متوسط الفيروسية مغلف جلايكوبروتين المسامير من الكترون Cryotomography إعادة بناء باستخدام Jsubtomo
Summary
An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Abstract
فيروسات يلفها تستخدم بروتينات سكرية غشاء على سطحها للتوسط الدخول إلى الخلايا المضيفة. التحليل البنيوي ثلاثي الأبعاد للبروتين سكري هذه "المسامير" في كثير من الأحيان تحديا تقنيا ولكنها مهمة لفهم المرضية الفيروسية وتصميم الأدوية. هنا، يتم تقديم بروتوكول للالفيروسي تحديد هيكل من خلال ارتفاع المتوسط الحسابي لبيانات البرد الإلكترون التصوير المقطعي. الإلكترون البرد المقطعي هو أسلوب في المجهر الإلكتروني يستخدم لاستخلاص ثلاثية الأبعاد للتصوير الشعاعي الطبقي حجم عمليات إعادة البناء، أو tomograms، العينات البيولوجية متعدد الأشكال مثل الفيروسات الغشاء في دولة المجمدة-رطب شبه مواطن. هذه tomograms تكشف هياكل الفائدة في ثلاثة أبعاد، وإن كان في دقة منخفضة. المتوسط الحسابي من وحدات التخزين الفرعية، أو tomograms الفرعية، هو ضروري للحصول على دقة أعلى من تكرار التفاصيل الزخارف الهيكلية، مثل ارتفاع بروتين سكري الفيروسية. نهج الحسابية مفصل لعليويرد gning والمتوسط tomograms الفرعية باستخدام حزمة البرامج Jsubtomo. هذا النهج يمكن تصور هيكل بروتين سكري المسامير الفيروسية إلى قرار في حدود 20-40 ألف والدراسة من أجل الدراسة من أعلى ارتفاع إلى ارتفاع التفاعلات على غشاء الفيريون. يتم عرض نتائج نموذجية لفيروس بونيامويرا، يلفها فيروس من عائلة الفيروسات البنياوية. هذه العائلة هي مجموعة متنوعة هيكليا من مسببات الأمراض التي تشكل خطرا على صحة الإنسان والحيوان.
Introduction
الإلكترون البرد المقطعي هو أسلوب التصوير الإلكترون المجهري البرد السماح للحساب وثلاثي الأبعاد (3D) اعادة اعمار العينات البيولوجية المعقدة. وتتراوح عينات مناسبة من مجمعات تنقية الجزيئات 1، 2 خيوط، حويصلات المغلفة 3، والفيروسات غشاء متعدد الأشكال 4 إلى خلايا أولية النواة كلها 5 وحتى المناطق رقيقة من الخلايا حقيقية النواة كلها 6. بعد جمع البيانات من سلسلة الميل، وحجم المقطعي 3D، أو tomograms، قد تحسب باستخدام العديد من حزم البرامج المعمول بها، بما في ذلك Bsoft 7 و 8 IMOD.
جانبين الملازمة لدراسة العينات البيولوجية بواسطة الحد الإلكترون البرد المقطعي التفسير البيولوجي للمجلدات المقطعي المقابلة. أولا، بسبب جرعة الإلكترون المحدودة التي يمكن تطبيقها على المواد البيولوجية قبل إدخال أضرار الأشعة كبير، SIGNAل إلى الضجيج في نسب البيانات للتصوير الشعاعي الطبقي وعادة ما تكون منخفضة جدا. ثانيا، نتيجة عينة محدودة الهندسة الميل أثناء جمع البيانات، بعض وجهات النظر من وجوه لا تزال غائبة، مما يؤدي إلى ما يسمى قطعة أثرية "إسفين مفقود 'في حجم المقطعي. ومع ذلك، كل من هذه القيود يمكن التغلب عليها إذا كان حجم المقطعي يحتوي على تكرار هياكل مماثلة، مثل المجمعات الجزيئات، التي يمكن أن تكون بنجاح متوسط 9-12.
قبل المتوسط من إعادة بناء هياكل مقطعية، والأشياء ذات الأهمية يجب إيجاد ومحاذاة إلى نفس التوجه. تحديد مكان هذه الهياكل يمكن تحقيقه عن طريق عبر الارتباط من هيكل القالب في حجم المقطعي باستخدام نهج غالبا ما يشار الى قالب مطابقة 13. القالب المستخدم في هذه العملية مطابقة يمكن أن تستمد من الإلكترون المجهري البرد أو البرد الإلكترون التصوير المقطعي جنبا إلى جنب مع 3D إعادة الإعمار، أو أنها يمكن أن تكون خريطة كثافة محاكاة منهيكل الذري. وقد وضعت عدة مجموعات الحسابية لتنفيذ هذه المهام 11.
في المتوسط من ارتفاع بروتين سكري من الفيروسات الغشاء، مثل HIV-1، وكان نهجا ناجحا بشكل خاص لدراسة بنيتها 14-16. فهم جزء لا يتجزأ هيكل للكشف عن كل من الأساس الجزيئي للفيروس التفاعلات المضيف وتوجيه التنمية تصميم المضادة للفيروسات واللقاحات. بينما البلورات الجزيئات هو الأسلوب المفضل لعالية الدقة (عادة أفضل من 4 Å) التحليل البنيوي من البروتينات السكرية الفيروسية الفردية والمجمعات، والهياكل الأشعة السينية الناتجة من هذه الطريقة هي من البروتينات المعزولة من البيئة الطبيعية غشائي على الفيريون . وبالتالي، تفاصيل مهمة مثل الهندسة المعمارية ترتيب أعلى من البروتينات السكرية الفيروسية، في سياق الفيريون، تبقى موجودة. من ناحية أخرى، والإلكترون المجهري البرد وإعادة الإعمار جسيم واحدمن الفيروسات يلفها بالكامل يقتصر على virions مع التماثل متعدد السطوح 17،18. وهكذا ظهرت الإلكترون cryotomography جنبا إلى جنب مع المحاذاة حجم الفرعي كتقنية مكملة السماح دراسة طفرات بروتين سكري من غير منتظمة الشكل، والفيروسات متعدد الأشكال في الموقع.
قمنا بتطوير برنامج يدعى Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) للكشف، والمحاذاة، والمتوسط للتصوير الشعاعي الطبقي مجلدات فرعية. وقد استخدمت Jsubtomo في تحديد هيكل عدد من الهياكل الخلوية والفيروسية 19-26. هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول مفصلة، والتي تمكن من تحديد الهياكل ارتفاع الفيروسي أرض. للتحايل على مدى صقل الهياكل المتوسط عن طريق الربط بين الضجيج، واعتمد مخطط "الذهب القياسية" صقل 10،27. أخيرا، وتناقش استراتيجيات التصور وتفسير النتائج النموذجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
معرفة الفيروسي هيكل بروتين سكري ارتفاع على غشاء الفيريون ضروري لفهم تكاثر الفيروس وتطوير علاجات لعلاج ومنع العدوى. وقد برز الإلكترون المجهري البرد جنبا إلى جنب مع واحد المتوسط الجسيمات كأسلوب الأكثر استخداما على حل هياكل جزيئات الفيروس يلفها، بما في ذلك ارتفاع بروتين سكري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على icosahedrally الفيروسات متماثل. هنا، من خلال تطبيق الإلكترون البرد المقطعي وsubtomogram المتوسط في Jsubtomo، وقد أوجزنا بروتوكول عام لتحديد طفرات بروتين سكري متعدد الأشكال على يلفها الفيروسات التي ليست قابلة للطرق البيولوجيا الهيكلية الحالية الأخرى. وتظهر نتائجنا التمثيلية أن حل هذه الطريقة كافية لتكشف عن نظرة ثاقبة العمارة المجال oligomerization، وارتفاع التنظيم ترتيب طفرات بروتين سكري على virions سليمة.
jove_content "> الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو بناء نموذجين انطلاق موثوقة أن تكون مستقلة إحصائيا عن بعضها البعض. التنفيذ الناجح لهذه الخطوة يفترض أن ارتفاع بروتين سكري هي كبيرة بما فيه الكفاية وليس ضد بعضهم البعض معبأة بإحكام جدا، بحيث يمكن طفرات فردية يتم الاعتراف بصريا ويدويا التقطت في tomograms، وبلغ متوسط نموذجين مستقلة. إذا لم يكن هذا ممكنا، وهما تعديلات على بروتوكول يمكن حاول أولا، نموذجين عشوائية مستقلة يمكن بناؤها من خلال تحديد أول اثنين من مجموعات فرعية عشوائية من subtomograms ثم حساب متوسط subtomograms داخل هذه المجموعات الفرعية 30. ثانيا، إذا استمدت هيكل من ارتفاع معزولة بوسائل أخرى، على سبيل المثال بواسطة البلورات بالأشعة السينية، يمكن استخدامه كنموذج البداية، ولكن يجب توخي الحذر لالمنخفض مرشح تمرير هذا النموذج باستخدام منخفضة الدقة قطع (50-70 أ)، عن اثنين من النماذج الناتجة في الجولة المقبلة من الصقل سوفتكون مستقلة إحصائيا فقط وراء هذا القرار. ونتيجة لهذا التحذير، ويوصى النهج السابق.القرار يمكن الحصول عليها من هذا البروتوكول يعتمد على أربعة عوامل رئيسية: ط. استراتيجية جمع البيانات ونوعية البيانات المدخلة، ثانيا. عدد subtomograms، والثالث. دقة محاذاة subtomograms، والرابع. عدم تجانس الهياكل. في حين أن القيد الأول والثاني يمكن التغلب عليها إلى حد كبير باستخدام إشارة إلى الضوضاء عالية للكشف عن مباشرة الإلكترون جنبا إلى جنب مع CTF تصحيح المقطعي وجمع البيانات الآلي، وتتأثر دقة محاذاة أبعد من حجم وشكل هيكل الفائدة نفسها. عند تطبيق هذا البروتوكول على المسامير الصغيرة التي تفتقر إلى السمات البارزة، قد يكون من المفيد ربط شظايا فاب للارتفاع لتحسين دقة المحاذاة، وبالتالي قرار 31. وأخيرا، إذا الهياكل أن متوسط المعرض التشكل متعددة، التصوير المقطعي الفرعييمكن استخدام أساليب تصنيف صباحا إلى متوسط التشكل مختلفة بشكل منفصل. تحقيقا لهذه الغاية، Jsubtomo يتكامل مع حزمة دينامو، وتقدم تصنيف subtomogram قوية 9.
بروتوكول أعلاه هو مكمل لالبلورات بالأشعة السينية من البروتينات السكرية الفيروسية المعزولة. يمكن تركيب الهياكل البلورات في المتوسطات مقطعية الفرعي للحصول على التوجيه الدقيق للبروتين سكري فيما يتعلق غشاء الفيريون. سيتم تطبيق هذه المنهجية تستمر بلا شك في تسليط الضوء على بنية فيروس يلفها والبيولوجيا المرضية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), 582-592 (2012).
