Summary

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em> Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan> Özel Transkript

Published: June 05, 2014
doi:

Summary

Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.

Abstract

Diseksiyon bir on yıl için DNA, RNA ve protein düzeylerinde dokuların incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM), bugün kullanılan en yaygın mikrodisseksiyon tekniktir. Bu teknikte, bir lazer fokal dehidre doku bölümü 1 üzerinde uzanan bir termoplastik zarı eritmek için kullanılır. Doku kesiti bileşik daha sonra kaldırılır ve membran ayrılır. Bu tekniği, doku inceleme için başarılı bir şekilde kullanılabilir olmasına rağmen, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, bu teknik kullanılarak prosedürlerin başarıyla tamamlanması böylelikle, bunun kullanımını sınırlayan, bir lazer kullanılmasını gerektirir. Mesodissection adlandırılan yeni daha ekonomik ve pratik bir yaklaşım mikrodisseksiyonla LCM tuzaklar olası bir çözümdür. Bu teknik, değirmen, bir slayt monte edilmiş doku numunesinden arzu edilen doku MESO-1/MeSectr sistemini kullanmaktadır eşzamanlı olarak arzu edilen bir doku örneği kurtarmak için sıvı dağıtma ve aspirasyon sırasındaBir sarf değirmen biraz. Diseksiyon işlemi başlamadan önce, kullanıcı (FFPE) gömülü formalin sabit parafin (H & E) referans slayt lekeli bir hematoksilen ve eozin ile slayt hizalar. Bundan sonra, operatör, arzu edilen diseksiyon alan annotates ve uygun bir bölümü incelemek için devam eder. Program diseksiyonu arşivlenmiş bir görüntü oluşturur. Mesodissection ana avantajı, bu deneyde nesil örnek kurmak on dakika ortalama alarak, bir slayt incelemek için gerekli kısa sürmesidir. Ayrıca, sistem önemli ölçüde daha düşük maliyetli ve kullanıcı dostudur. Hafif bir dezavantajı, bu lazer yakalama mikroskopisi gibi hassas olmasıdır. Bu yazıda mesodissection Mycobacterium tuberculosis (MTB) neden FFPE granülomlarında slaytları RNA ayıklamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Introduction

Numuneler geleneksel elle bütün doku veya bir iğne ve neşter kullanılarak slaytlar birinden microdissected edilmiştir. Bu ilgi doku bölümünde ve çevre dokular bölümleri 2 arasında net bir ayrım gerektirir. Moleküler profil teknolojideki gelişmeler sayesinde, hücresel düzeyde doku değerlendirmek için artan bir ihtiyaç söz konusudur. Nedeniyle manuel mikrodisseksiyon sınırlamaları, LCM dahil teknikler daha fazla izolasyon hassasiyet sağlamak için kuruldu. Bu teknik, bir araştırmacı daha sonra, gen ekspresyonu profillemesi gibi alt-deneyleri için kullanılan çeşitli hücre tipleri ve slayt belirli hücre popülasyonlarının, izole sağlar. Alt deneyleri için çok etkili olsa da, LCM sınırlama olmadan değildir. Birincisi, LCM pahalı ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca nedeniyle RNA kararsız doğası, genellikle LCM örneklerinden 2 yüksek kalitede RNA elde etmek zordur. Nedeniyle diLCM sadvantages mikrodisseksiyon teknolojisindeki yeni gelişmeler hala bir ekonomik ve zaman hassas bir şekilde araştırmacıların daha fazla sayıda daha erişilebilir hale getirmek için gereklidir.

Şu anda mevcut mikrodiseksiyon teknolojide Böyle bir gelişme mesodissection olarak bilinen bir tekniktir. Bu teknikte bir makine değirmen ilgi açıklamalı doku kesiti için kullanılan ve bir tüketim değirmen parça 3 içine emer. Daha sonra, bu numune bir toplama tüpüne aspire edilir ve alt uygulamaları için de kullanılabilir. Bu sistemin avantajı, belirgin olarak daha az pahalı ve zaman duyarlı olmasıdır. Bizim tecrübelerimize göre, sistem on dakika içinde bir akciğer granülom dokusu bölümünün diseksiyon sağlar. Öte yandan, geleneksel LCM olasılıkla işlemini tamamlamak için saat gerektirir. Sistem operatörü açıklama için bir karşılaştırma yanı sıra aracı olarak kullanmak için bir referans slayt yüklemenizi sağlar. Ayrıca bir rapor özetleyen inci oluşturulurdisseke slayt e alanı. Mesodissection iki ana dezavantajı vardır. Birden fazla hücre ayıklanması etkili olmasına rağmen, tek bir hücreyi izole etmek zordur. Buna ek olarak, oluşturulan görüntünün hassas diğer görüntüleme mikroskop kullanıyorsanız kadar net değildir.

Tüberküloz (TB) önemli bir enfeksiyon hastalığı tüm dünyada insanlığın katil ve Mtb ile enfeksiyondan sonuçlanır. Mtb aerosollerle maruz kalan bireylerin çoğunda, latent enfeksiyon sınırlıdır. Yılda en az 10 milyon kişi, aktif verem hastalığı 4. sonuçlanır. Latent enfeksiyon esnasında, Mtb granülomlar olarak bilinen patolojik lezyonların içinde bulunur. Dolayısıyla Mtb enfeksiyon sonucu granülom 5 seviyesinde karar olduğu ileri sürülmüştür.

Burada mesodissection Mtb neden granülomlarını microdissect için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Kullanılan slaytlarEnfekte rhesus makakların FFPE akciğer dokusundan bulunmaktadır. Bu gösteri amaçla, kendi bütünlükleri içinde granülomlar teşrih edecek. Ayrıca RNA geri dokusundan elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu teknik, çeşitli örneklerden doku örnekleri uygulanır ve daha sonra aşağı doğru bir çok analizde kullanılabilir.

Protocol

2iD Görüntüleme Yazılımı ile 1. Kalibre Mesodissection Enstrüman 2iD görüntüleme yazılımı bu maddenin geri kalanı için yazılım veya program ya olarak adlandırılacaktır. Bu adımı doğru görüntüyü izlemek yanı sıra birden fazla slayt kareleri uyum için gereklidir. Enstrüman ve bilgisayarı açın. Açık yazılım ve "kalibrasyon aracı" seçeneğini seçin. Joystick'i kullanarak sahne seyahat kalibre. Sol üst konuma a…

Representative Results

Anılan protokol FFPE doku slaytlar RNA ayıklamak için yeni bir mesodissection tekniği nasıl kullanılacağını gösterir. Bu protokolün etkinliği çeşitli enfeksiyon aşamalarında Mtb ile enfekte NHP'ın akciğer granülomlarının FFPE slaytlar aracılığıyla gösterilir. 1-3 alet. Şekil 4. görüntüleri Rakamlar diseksiyon sürecinin nasıl oluştuğunu gösteriyor ve yazılım. Tablo 1. tarafından oluşturulan çıkan gör…

Discussion

Mesodissection patojenlerin geniş bir dizi neden olduğu patolojik lezyon slaytlardan RNA ekstre uygulanabilir bir tekniktir. Bu kullanıcı görüntü izler ve doğru olarak görüntü hizalayan bir zorunluluktur. Bunu gerçekleştirmek için, alet görüntüleme yazılımı yönleri aşağıdaki kalibre edilmelidir. Diseksiyon disseke ilgi slayt ve alan uyum yoksa, kullanıcı tekrar kalibrasyon gerekir. Diseksiyon sürecinde bir diğer kritik adım, diseksiyon önce (5.1 Adım) kabarcıklar yoksun böyle bir şekild…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, ve P51OD011104: Yazarlar bu araştırmanın destek için aşağıdaki NIH ödül / subawards kabul etmek istiyorum.

Materials

MeSectr AvanSci Bio Mesodissector
400 nm xScisors AvanSci Bio Other sizes available
THOR AvanSci Bio Programmable Heater-Shaker
NanoDrop2000 ThermoScientific ND-2000
RNeasy FFPE extraction kit  Qiagen 73504
Ovation RNA-Seq FFPE System  Nugen 7150
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104

References

  1. Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
  2. Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
  3. Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
  4. Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
  5. Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
  6. AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
  7. Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
  8. Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
  9. Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
  10. Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
  11. Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
  12. Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
  13. Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).

Play Video

Cite This Article
Hudock, T. A., Kaushal, D. A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. J. Vis. Exp. (88), e51693, doi:10.3791/51693 (2014).

View Video