Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi
Summary
Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.
Abstract
Microdissezione è stato utilizzato per l'esame dei tessuti a DNA, RNA e proteina livelli per oltre un decennio. Microscopia laser capture (LCM) è la tecnica di microdissezione più comune usato oggi. In questa tecnica, un laser viene utilizzato per fondere focally una membrana termoplastica che sovrasta una sezione di tessuto disidratato 1. La sezione di tessuto composito viene poi sollevato e separato dalla membrana. Sebbene questa tecnica può essere utilizzata con successo per l'esame dei tessuti, è lunga e costosa. Inoltre, il completamento delle procedure utilizzando questa tecnica richiede l'uso di un laser, limitando così il suo utilizzo. Un nuovo approccio microdissezione più conveniente e pratico chiamato mesodissection è una possibile soluzione per le insidie di LCM. Questa tecnica impiega il sistema MESO-1/MeSectr al mulino tessuto desiderato da un campione di tessuto scorrevole montato mentre contemporaneamente dispensando ed aspirando fluido per recuperare il campione di tessuto desiderato nellaun po 'mulino di consumo. Prima che inizi il processo di dissezione, l'utente allinea formalina paraffina fisso incorporato (FFPE) scorrere con un ematossilina e eosina macchiato (H & E) di riferimento diapositiva. Successivamente, l'operatore annota la zona dissezione desiderato e procede a sezionare il segmento appropriato. Il programma genera un'immagine archiviata della dissezione. Il vantaggio principale di mesodissection è la breve durata necessaria per sezionare una diapositiva, stabilendo una media di dieci minuti dal impostato per campionare generazione in questo esperimento. Inoltre, il sistema è molto più conveniente e facile da usare. Un leggero svantaggio è che non è preciso come microscopia laser capture. In questo articolo mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per estrarre RNA da diapositive da granulomi FFPE causate da Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
I campioni sono stati tradizionalmente microdissezione manualmente sia da tutto il tessuto o diapositive utilizzando un ago e bisturi. Ciò richiede una netta separazione tra la sezione di tessuto di interesse e dei tessuti circostanti le sezioni 2. Con i progressi attuali nella tecnologia profiling molecolare, vi è stata una crescente necessità di valutare il tessuto a livello cellulare. A causa delle limitazioni di microdissezione manuale, sono stati stabiliti tecniche tra cui LCM per consentire una maggiore precisione di isolamento. Questa tecnica consente al ricercatore di isolare specifiche popolazioni cellulari da vari tipi di cellule e diapositive, che possono poi essere utilizzati per saggi valle come espressione genica. Sebbene molto efficace per saggi a valle, LCM non è senza limitazioni. Primo, LCM è un processo costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della natura instabile di RNA, è spesso difficile da ottenere RNA di alta qualità da campioni LCM 2. A causa della disadvantages di LCM, nuovi progressi nella tecnologia microdissezione sono ancora necessari per renderlo più accessibile a un maggior numero di ricercatori in maniera sensibile conveniente e tempo.
Un tale progresso della tecnologia microdissezione ora disponibile è una tecnica nota come mesodissection. In questa tecnica una macchina viene utilizzata per la lavorazione della sezione di tessuto annotato di interesse e aspirati in un po mulino consumabile 3. Quindi, questo esempio può essere aspirato in un tubo di raccolta e utilizzata per applicazioni a valle. I vantaggi di questo sistema sono che è molto meno costoso e delicato momento. Nella nostra esperienza, il sistema consente la dissezione di una sezione di tessuto polmonare granuloma in dieci minuti. D'altra parte, LCM tradizionale sarebbe probabilmente richiederà ore per completare il processo. Il sistema permette all'operatore di caricare una diapositiva di riferimento da utilizzare come confronto così come strumento per l'annotazione. Inoltre, viene generato un report che illustra the area del vetrino che è stato sezionato. Ci sono due svantaggi principali mesodissection. Sebbene efficace a estrarre più celle, è impegnativo per isolare una singola cella. Inoltre, la precisione dell'immagine generata non è chiaro come se si utilizzano altri microscopi di imaging.
La tubercolosi (TB) è una importante malattia mortale contagiosa dell'umanità in tutto il mondo e risultati da infezione da Mtb. In una maggioranza di individui esposti ad aerosol di Mtb, l'infezione è latente limitato. In almeno 10 milioni di persone ogni anno, si traduce in malattia tubercolare attiva 4. Durante l'infezione latente, Mtb è contenuto all'interno lesioni polmonari patologiche conosciuti come granulomi. Quindi si è sostenuto che l'esito dell'infezione Mtb viene deciso a livello del granuloma 5.
Qui mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per microdissect granulomi causati da Mtb. Le slide utilizzatesono da FFPE tessuto polmonare di macachi Rhesus infetti. Ai fini di questa dimostrazione, saremo sezionare granulomi nella loro interezza. Abbiamo inoltre dimostrato che l'RNA può essere estratto dal tessuto recuperato. Questa tecnica può essere applicata a campioni di tessuto da vari altri campioni e poi utilizzato per una varietà di saggi a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection è una tecnica che può essere applicata per l'estrazione di RNA da diapositive lesioni patologiche causate da una vasta gamma di agenti patogeni. È una necessità che l'utente ascolti l'immagine e allinea correttamente l'immagine. Per fare questo, lo strumento deve essere calibrato seguendo le indicazioni sul software di imaging. Quando dissezione, se la slitta e la zona di interesse essere sezionato non si allineano, l'utente deve ricalibrare lo strumento. Un altro punto critico nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere i seguenti premi NIH / subawards per il sostegno di questa ricerca: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
