A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen
Summary
Microdissectie is uitgebreid toegepast voor de behandeling van DNA, RNA en eiwitten in weefsel. Laser capture microscopie (LCM) is de meest gebruikte methode, maar een nieuwe frees-techniek, mesodissection, is sinds kort beschikbaar. We tonen RNA extractie uit mesodissected formaline gefixeerd paraffine-ingebed weefsel slides van Mycobacterium tuberculosis granulomen.
Abstract
Microdissectie is gebruikt voor de behandeling van weefsels aan DNA, RNA en eiwit meer dan tien jaar. Laser capture microscopie (LCM) is de meest voorkomende microdissection techniek die tegenwoordig worden gebruikt. In deze techniek wordt een laser gebruikt om een thermoplastisch membraan dat een gedehydrateerde weefselsectie 1 ligt over focaal smelten. De weefselsectie composiet wordt vervolgens opgetild en gescheiden van het membraan. Hoewel deze techniek met succes kan worden gebruikt voor weefselonderzoek, is tijdrovend en duur. Bovendien is de succesvolle voltooiing van de procedures die deze techniek vereist het gebruik van een laser, waardoor het gebruik ervan beperkt. Een nieuwe, meer betaalbare en praktische microdissection aanpak genoemd mesodissection is een mogelijke oplossing voor de valkuilen van LCM. Deze techniek maakt gebruik van de MESO-1/MeSectr systeem om de molen van de gewenste weefsel van een dia gemonteerd weefselmonster terwijl tegelijkertijd de verstrekking en het opzuigen van vloeistof naar de gewenste weefsel monster in herstelleneen verbruiksartikel molen beetje. Voordat de dissectie proces begint, de gebruiker lijnt de formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) schuiven met een hematoxyline en eosine gekleurde (H & E) verwijzing glijbaan. Daarna, de exploitant annoteert de gewenste dissectie gebied en overgaat tot het passende segment ontleden. Het programma genereert een gearchiveerd beeld van de dissectie. Het belangrijkste voordeel van mesodissection is de korte duur die nodig is om een dia te ontleden, met een gemiddelde van tien minuten van het opzetten op generatie proeven in dit experiment. Bovendien is het systeem significant meer kosteneffectief en gebruiksvriendelijk. Een klein nadeel is dat het niet zo precies laser capture microscopie. In dit artikel laten we zien hoe mesodissection kunnen worden gebruikt om RNA te extraheren uit dia uit FFPE granulomen veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Monsters zijn traditioneel handmatig gemicrodissecteerde van zowel hele weefsel of dia's met behulp van een naald en scalpel. Daartoe is een duidelijke scheiding tussen het gedeelte weefsel van belang en de omliggende weefsels in paragraaf 2. Met de huidige vooruitgang in de moleculaire profilering technologie, is er een toenemende behoefte om weefsel te beoordelen op cellulair niveau. Door de beperkingen van de handleiding microdissectie werden technieken, waaronder LCM vastgesteld grotere isolatie precisie mogelijk. Deze techniek kan de onderzoeker bepaalde celpopulaties uit verschillende cellen en schuif soorten, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse testen zoals genexpressie profilering isoleren. Hoewel zeer effectief voor stroomafwaartse testen, LCM is niet zonder beperkingen. Eerst LCM is een duur en tijdrovend proces. Bovendien, vanwege de instabiele aard van RNA, is het vaak uitdagend om hoge kwaliteit te verkrijgen van RNA LCM monsters 2. Door het disadvantages van LCM, zijn nieuwe ontwikkelingen in microdissection technologie nog steeds nodig om het meer toegankelijk voor een groter aantal onderzoekers in een betaalbare en tijd gevoelige manier te maken.
Een van deze vooruitgang in microdissection technologie nu beschikbaar is een techniek die bekend staat als mesodissection. Bij deze techniek wordt een machine wordt gebruikt om de molen van de geannoteerde weefsel sectie van belang en zuigt het in een voor consumptie molen bit 3. Vervolgens kan dit monster worden opgezogen in een verzameling buis en gebruikt voor verdere toepassingen. De voordelen van dit systeem is dat het aanzienlijk goedkoper en tijdgevoelig. In onze ervaring, het systeem maakt het mogelijk de dissectie van een long granuloom weefsel sectie in tien minuten. Aan de andere kant, zou de traditionele LCM waarschijnlijk uren nodig om het proces te voltooien. Het systeem kan de bestuurder een verwijzing dia laden om te gebruiken als een vergelijking als hulpmiddel voor annotatie. Bovendien is een rapport gegenereerd waarin the gebied van de dia die werd ontleed. Er zijn twee belangrijke nadelen aan mesodissection. Hoewel effectief bij het extraheren meerdere cellen, is het moeilijk om een cel te isoleren. Bovendien is de nauwkeurigheid van het beeld dat is gegenereerd is minder duidelijk bij gebruik van andere imaging microscopen.
Tuberculose (TB) is een belangrijke besmettelijke ziekte moordenaar van de mensheid over de hele wereld en de resultaten van infectie met Mtb. In een meerderheid van de mensen blootgesteld aan aërosolen van Mtb, wordt de infectie latent beperkt. In ten minste 10 miljoen mensen per jaar, het resulteert in actieve tuberculose ziekte 4. Tijdens de latente infectie, wordt Mtb vervat in pathologische longlaesies bekend als granulomen. Daarom is betoogd dat de uitkomst van Mtb infectie wordt besloten op het niveau van het granuloom 5.
Hier laten we zien hoe mesodissection kan worden om granulomen veroorzaakt door Mtb microdissect. De slides gebruiktzijn van FFPE longweefsel van geïnfecteerde rhesus makaken. Ten behoeve van deze demonstratie, zullen we granulomen ontleden in hun geheel. We tonen ook dat RNA van het teruggewonnen weefsel kan worden geëxtraheerd. Deze techniek kan worden toegepast op weefselmonsters van diverse andere monsters en vervolgens gebruikt voor verschillende stroomafwaartse testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection is een techniek die kan worden toegepast op RNA-extractie uit pathologische laesie dia veroorzaakt door een breed scala van pathogenen. Het is een noodzaak dat de gebruiker het beeld volgt en lijnt de afbeelding correct. Om dit te bereiken, moet het instrument worden gekalibreerd volgens de aanwijzingen op de imaging software. Bij het ontleden, als de glijbaan en interessegebied wordt ontleed niet op een lijn, de gebruiker moet het kalibreren. Een andere belangrijke stap in de dissectie proces is het verb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de volgende NIH awards / subawards voor de ondersteuning van dit onderzoek luidt: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, en P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
