מערכת העבודה לב מבודדת למודלים בבעלי חיים גדולים
Summary
Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.
Abstract
מאז השקתו בסוף המאה ה 19, מנגנון Langendorff המבודד זלוף לב, והפיתוח הבא של מודל הלב עובד, היו כלים רב ערך לחקר תפקוד ובמחלות לב וכלי דם 1-15. למרות הכנת לב Langendorff יכולה לשמש לכל לב של יונקים, רוב המחקרים שכלל מנגנון זה משתמשים במודלים של בעלי חיים קטנים (למשל, עכבר, חולדה, וארנבת) בשל המורכבות הגוברות של מערכות ליונקים גדולים 1,3,11. קושי העיקרי הוא להבטיח לחץ זלוף כלילי קבוע על פני טווח של גדלי לב שונים – מרכיב מרכזי של כל ניסוי ניצול מכשיר זה 1,11. על ידי החלפת עמודת afterload ההידרוסטטי הקלאסית עם משאבה צנטריפוגלית, מנגנון הלב עובד Langendorff המתוארת להלן מאפשר התאמה קלה ורגולציה הדוקה של לחץ זלוף, כלומר את אותה ההגדרה יכולה לשמש למצלצלים שוניםים או גדלי לב. יתר על כן, תצורה זו יכולה גם לעבור בצורה חלקה בין לחץ קבוע או זרימה קבועה במהלך reperfusion, בהתאם להעדפות של המשתמש. האופי הפתוח של הגדרה זו, למרות מה שהופך את ויסות טמפרטורה קשה יותר מעיצובים אחרים, מאפשר לאיסוף קל של נתונים בלחץ בנפח שפכים וחדרים.
Introduction
חלק גדול מההבנה של ביולוגיה לב בסיסית ופיזיולוגיה שלנו הגיע מניסויים שמנוצלים, הלב המבודד-perfused מדרדר Langendorff ומערכות לב עובדות המבודדות. מערכות ניסיוניות אלה עדיין נמצאים בשימוש נרחב היום כדי להרחיב את הידע של הלב וכלי הדם שלנו בנושאים חשובים, ובם איסכמיה reperfusion פציעה 2, נפשית מראש 4 טיפול, תא המבוסס על שריר הלב פגוע 5,7, את ההשפעות של תרופות לב 6,9, ושימור של שתל לב טכניקות 8,15-18.
בעוד שני מערכות לב מבודדות יכולות לשמש לכל מיני יונקים, הם משמשים בעיקר על יונקים קטנים, כגון שפן ניסיונות, חולדה, או ארנבת 3,12,13 כ. דגמים גדולים יותר של בעלי חיים, כגון חזירים ובני אדם, לספק נתונים יותר קליני רלוונטיים, אך בתדירות נמוכה יותר בשימוש בשל עלות גבוהה יותר, שונות ביולוגיות גדולות יותר, נפח גדול יותר של פתרונות זלוף הדם, וbiggאה חתיכות של ציוד 1,12-15. יתר על כן, איסוף הנתונים הוא קשה יותר, במיוחד ללבם עובד מבודד 1,3,12-15. כתוצאה ממורכבויות אלה, מודלים לב מבודדים קליני רלוונטיים נמצאים בשימוש לעתים רחוקות, באופן חמור פוגע בהתקדמות של מחקר translational לב וכלי דם.
בניסיון לפתור את המורכבויות האלה, הכנת הלב עובדת המבודדת שונה כדי ליצור מערכת שניתן להתאים בקלות ללבם של מינים שונים, כולל בני אדם, תחת לחץ או קבוע או תנאי הזרימה Langendorff קבועים. קאמרי עמידת afterload הוחלף במשאבה צנטריפוגלית כדי לפשט את התהליך של התאמת לחץ זלוף במצב Langendorff וafterload במצב עבודה. במקום מאגר סגור, במעייל כדי להכיל את הלב, מערכת זו משתמשת בתא פתוח כדי להפוך את איסוף הנתונים לקל יותר, כך שהיא מאפשרת שימוש בגישת transapical לצנתור מוליכות. Moreovאה, עיצוב פתוח זו מאפשר גישה להערכת אקו הלב, מרחיב עוד יותר את הפרמטרים הפיזיולוגיים הניתנים למדידה בניסויים אלה. שיפורים אלה יהיו בתקווה לעודד אחרים להשתמש במערכת זו למחקר translational בעלי החיים גדול.
Protocol
Representative Results
Discussion
מנגנון Langendorff המבודד זלוף לב ומודל לב עובד הובילו לכמה מהתגליות הבסיסיות ביותר בפיזיולוגיה של לב, פתולוגיה ופרמקולוגיה. הרבגוניות של מודל זה מאפשרת את השימוש בו עם מגוון רחב של מינים תחת מגוון רחב של תנאים נורמלים ופתולוגיים 1-18. עם זאת, מודל הלב מבודד אינו משמש בדרך כלל ליונקים גדולים, במיוחד לב אנושי, בחלקו בשל המורכבות מוגברות של שניהם עיצוב מכשירים ואיסוף נתונים. לכן, הפרוטוקול שהוצג במסמך זה מדגים ניסיון לשפר את המורכבויות האלה, כי התוצאות באמצעים יחסית לשחזור של לימוד לבבות חזיריים מבודדים.
מרכיב חיוני של ההתקנה שלנו הוא החלפת קאמרית העמידה העורק / afterload עם משאבה צנטריפוגלית. החלפה זו מאפשרת שליטה משופרת של הלחץ כלילי זלוף וafterload בLangendorff ומצבי לב עובדים, respectively, מאפשר הגדרה זו כדי להתאים בקלות ללבם של גדלים ומינים שונים. לדוגמא, בעיצוב הזה, לבבות חזיריים הם reperfused ב40-45 מ"מ כספית, ואילו לבבות אנושיים reperfused ב60-65 מ"מ כספית. שינוי בלחץ זו מושגת רק על ידי התאמת ההגדרות של המשאבה צנטריפוגלית; אין מרכיב של המערכת צריך להיות מותאם באופן פיזי. יתר על כן, הצבת מתמר לחץ בתוך שורש אב העורקים כדי לפקח על לחצי שורש מאפשרת מעבר קל בין זרם בלתי פוסק ולחץ מתמיד במצב Langendorff. למרות שינוי זה מסיר קאמרי הקלאסי ציות, משאבת צנטריפוגלי, כך שהוא מאפשר זרימה דו כיוונית מתרחשת מבוססת על הפרש לחצים, יכול לשמש כחדר תאימות. עם התכווצות ונפלט נפח פעימה, זרימה מדרדר על פני המשאבה משמשת להפחתת לחץ afterload, משכפלות את הגמישות של אב העורקים.
העיצוב הפתוח של מנגנון זה הוא גם חשוב. לאחר שהלב תלוי בפתוחפלילית, במקום תא מוקף חצי או משפך, מאפשר למכשור קל יותר למדידות לחץ בנפח. העיצוב הפתוח מאפשר שימוש בחתך transapical עבור מיקום צנתר LV, הימנעותה של גישת transvalvular. גישת transvalvular היא יותר קשה מבחינה טכנית, ודורשת בדרך כלל שיקוף למיקום נכון. יתר על כן, גישה זו יכולה גם לגרום לאי ספיקה מסתמית. על ידי שימוש בגישת transapical, אנו בבטחה ובקלות למקם את הצנתר בתוך החדר השמאלי תוך ביטול את העלות ואי נוחות של שיקוף נוסף. העיצוב הפתוח גם מאפשר גישה קלה לאקו ואיסוף שפכים, מרחיב עוד יותר את הפרמטרים תפקודיים וביוכימיים שניתן להעריך בזמן שעל מערכת זו.
העיצוב הפתוח, תוך הקלת איסוף נתונים, עושה את ויסות טמפרטורת שריר הלב קשה יותר. שמירה על הטמפרטורה פיזיולוגית היא אחת הבעיות המוכרות בLangendorffאו עובד מערכת לב 1,3,11,13. מערכת Langendorff בדרך כלל מכילה תא תרמי, המסייע לשמור על טמפרטורה נכונה, אבל החדר הזה גם עושה החדרת קטטר לחץ בנפח חדרית קשה יותר. כדי לפתור את ויסות הטמפרטורה הנחותה של העיצוב הפתוח, מחליף oxygenator / חום הוצב לאחר המאגר. השטח המינימלי בין מחליף החום וצינורית אב העורקים מפחית את אובדן חום, ובדיקת טמפרטורת שריר הלב מבטיחה טמפרטורה נורמלית. גם השימוש בצינורות במעייל או מקורות חימום חיצוניים יכולים לשמש כדי לעזור עם בקרת טמפרטורה.
עוד אלמנט ייחודי של פרוטוקול זה הוא שטיפת הדם עצמי של החזיר תחת מחקר ושחזר אותו עם מלח רגיל. אמנם, השימוש בשני perfusates כל הדם או תאי דם אדומים מוגבר עם מאגרי גבישן אין זה נדיר, שהיא עושה בהווה עם בעיות. לשעבר דורש בדרך כלל בעלי חיים תורמים, אשר מוסיף substעלויות antial לניסוי, ואילו השני יכול להיות בעיות immunogenicity, שכן הוא בדרך כלל נגזר מ1,11-13 דם שור. על ידי שטיפת הדם של החזיר המקורי, הפרוטוקול מחייב רק חיה אחת וסוגיות immunogenicity הם מלוטשים. כמו כן, תהליך השטיפה מסיר את רוב אלקטרוליטים, כלומר הם יכולים להשפיע בקלות לכל הפרמטרים הניסיוניים. לבסוף, באמצעות יחידת שימור דם מסיר את רוב החלבונים בתוך הדם, שהוא גם יתרון וחסרון של תהליך זה. היתרון הוא שכל קרישה וחלבונים חיסוניים / זיהומיות יוסרו, ומקטינים את הסיכוי לקרישים או זיהום. החסרון הוא שיש לו את תערובת לחץ oncotic נמוך, מה שיכול להוביל לבצקת בשריר הלב ואולי אובדן של תפקוד לב לאורך זמן. בעיה זו ניתן לטפל, עם זאת, באמצעות התוספת של אלבומין או קולואיד אחר.
הבטחה כי גודל כראויimal וקטטר שנבחרו הוא חשוב כמו שימוש במנגנון לב עבודה התקין. באופן אידיאלי, קטטר יוצב עם כל אלקטרודות החישה בתוך החלל של החדר, עם שתי אלקטרודות עירור (כלומר אלקטרודות הפרוקסימלי ביותר) מחוץ לחלל החדר. אם חלל חדרו של בעל החיים הוא קטן מדי, או את המרווח בין האלקטרודות הוא גדול מדי, ואז כל המגזרים לא יהיו כשירים בתוך המרחב LV. אמנם המיקום של האלקטרודות העירור יכול להיות מותאם, חלל LV קטן יכול גם הוא לגרום לקטטר כדי לכופף או עקום, מה שהופך את איסוף הנתונים קשה. לכן, לניתוח תפקודי של לב של בעלי חיים גדולים, בגודל של בעלי חיים של לפחות 60 קילוגרם מומלץ. עם בעלי חיים בגודל זה, מרווח בין האלקטרודה של 7 מ"מ בדרך כלל מאפשר להחדרת הקטטר מלאה.
לסיכום, כתב היד הזה מתאר מערכת מבודדת עובדת לב שמפשטת ויסות לחץ זלוף, col נתוניםבחירה מקדימה, ועיצוב כללי, תוך בקרת טמפרטורה רק מעט יותר קשה. שינויים אלה אל הלב עובד הבודד בתקווה לאפשר לשימוש עם לב של יונקים גדולים, כולל בני אדם הגדיל אותו, לקדם את ההבנה של הפתולוגיה הלב ומאפשר אפשרויות טיפול יותר קליני רלוונטיות להתגלות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
There are no acknowledgments.
Materials
| PowerLab 16/35 with LabChart Pro | ADInstruments | PL3516/P | |
| MPVS Ultra Pressure-Volume Unit | ADInstruments | 880-0168 | |
| Ventri-Cath Catheter (5F, 12E, 7mm, DField, Straight, 122cm) | Millar | VENTRI-CATH-507s | |
| Pressure Catheter (3.5F, Single, Straight, 100cm, Ny, Non Repairable) | Millar | SPR-524 | |
| PV Extension Cable (10ft) | ADInstruments | CEC-10PV | |
| Catheter Interface Cable (10ft) | ADInstruments | PEC-10D | |
| Rho Calibration Cuvette | ADInstruments | 910-1060 | |
| MPVS Ultra BNC Cable Pack | ADInstruments | 880-0172 | |
| Autotransfusion system | Sorin | 7320000 | |
| Bowl Set with Low Volume (135 ml) Centrifuge Bowl | Sorin | 7135100 | |
| Oxygenator/Heat Exchanger | Terumo | 3CXSX18RX | |
| Perivascular flow probe | Transonic Systems | PAU Series | Size of flow probe will depend on animal size; for 60 kg pig, recommend 20 or 24 mm probe |
| Perivascular flowmeter module | Transonic Systems | TS420 | |
| Myocardial temerpature sensor | Smiths Medical | MTS-40015 | |
| 16 G 1" Regular needle | BD Inc. | 305197 | |
| 4-0 polypropylene suture (double-arm) | Ethicon | 8526H | For purse-string stitches |
| 2-0 polypropylene suture (single-arm) | Ethicon | 8833H | |
| Cable ties | ULINE | S-1021 | |
| Cable tie gun | ULINE | H-241 | |
| Clear, Flexible PVC Tubing | VWR International | 89068 | Inner diameter depends on cannulas, pumps and other equipment used; most commonly use 1/4", 3/8" tubing |
| Straight Tubing Connectors | VWR International | 46600 | |
| Y-Shaped Tubing Connectors | Thermo Scientific | 6152 | |
| Jacketed Bubble Trap | Radnoti | 14040 | For preload chamber |
| Centrifugal pump | Maquet | 70105 | The centrifugal pump and roller pumps were obtained used from perfusion department after clinical use. |
| Roller pumps | Maquet | HL-20 | |
| Hemostasis Valve | Merit Medical | MAP150 | |
| Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 570001000 |
References
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, 113-126 (2007).
- Cheung, P. Y., et al. Matrix metalloproteinase-2 contributes to ischemia-reperfusion injury in the heart. Circulation. 101, 1833-1839 (2000).
- Ytrehus, K. The ischemic heart–experimental models. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 42, 193-203 (2000).
- Ferdinandy, P., Schulz, R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. British Journal of Pharmacology. 138, 532-543 (2003).
- Ohno, N., et al. Transplantation of cryopreserved muscle cells in dilated cardiomyopathy: effects on left ventricular geometry and function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126, 1537-1548 (2003).
- Hamlin, R. L., et al. Sensitivity and specificity of isolated perfused guinea pig heart to test for drug-induced lengthening of QTc. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 15-23 (2004).
- Lee, M. S., Lill, M., Makkar, R. R. Stem cell transplantation in myocardial infarction. Reviews in Cardiovascular Medicine. 5, 82-98 (2004).
- Ryugo, M., et al. Myocardial protective effect of human recombinant hepatocyte growth factor for prolonged heart graft preservation in rats. Transplantation. 78, 1153-1158 (2004).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 171-181 (2004).
- Southworth, R., Blackburn, S. C., Davey, K. A., Sharland, G. K., Garlick, P. B. The low oxygen-carrying capacity of Krebs buffer causes a doubling in ventricular wall thickness in the isolated heart. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83, 174-182 (2005).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 597-603 (2000).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 613-627 (2000).
- Hill, A. J., et al. In vitro studies of human hearts. Ann Thorac Surg. 79, 168-177 (2005).
- Colah, S., et al. Ex vivo perfusion of the swine heart as a method for pre-transplant assessment. Perfusion. 27, 408-413 (2012).
- Ozeki, T., et al. Heart preservation using continuous ex vivo perfusion improves viability and functional recovery. Circ J. 71, 153-159 (2007).
- Garbade, J., et al. Functional, metabolic, and morphological aspects of continuous, normothermic heart preservation: effects of different preparation and perfusion techniques. Tissue engineering. Part C, Methods. 15, 275-283 (2009).
- Poston, R. S., et al. Optimizing donor heart outcome after prolonged storage with endothelial function analysis and continuous perfusion. Ann Thorac Surg. 78, 1362-1370 (2004).
