نظام القلب العامل المعزولة لنماذج حيوانية كبيرة
Summary
Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.
Abstract
منذ بدء العمل به في أواخر القرن ال 19، وLangendorff معزولة جهاز نضح القلب، والتطور اللاحق للنموذج قلب العمل، كانت أدوات لا تقدر بثمن لدراسة وظيفة القلب والأوعية الدموية وأمراض 1-15. على الرغم من أن إعداد القلب Langendorff يمكن استخدامها لأي قلب الثدييات، معظم الدراسات التي تنطوي على استخدام هذا الجهاز النماذج الحيوانية الصغيرة (مثل الجرذان والفئران، والأرانب) ويرجع ذلك إلى تزايد تعقيد نظم للثدييات أكبر 1،3،11. واحد صعوبة كبيرة في ضمان ثابت ضغط التروية التاجية أكثر من مجموعة واسعة من الأحجام القلب المختلفة – عنصرا أساسيا في أي تجربة استخدام هذا الجهاز 1،11. عن طريق استبدال العمود حمولة تلوية الهيدروستاتيكي الكلاسيكية مع مضخة طرد مركزي، والعمل Langendorff جهاز القلب هو موضح أدناه يسمح لسهولة التكيف وتنظيم محكم من الضغوط نضح، وهذا يعني نفس مجموعة المتابعة يمكن استخدامها لمختلف مسكوكةق أو أحجام القلب. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذا التكوين أيضا التبديل بسهولة بين الضغط المستمر أو تدفق مستمر خلال ضخه، اعتمادا على تفضيلات المستخدم. الطبيعة المفتوحة لهذا الإعداد، على الرغم مما تنظيم درجة الحرارة أكثر صعوبة من تصاميم أخرى، ويسمح لجمع البيانات من السهل الضغط حجم النفايات السائلة والبطين.
Introduction
لقد حان بكثير من فهمنا لعلم الأحياء وعلم وظائف القلب الأساسية من التجارب التي استخدمت معزولة، إلى الوراء، perfused قلب Langendorff ونظم القلب تعمل معزولة. لا تزال تستخدم على نطاق واسع هذه النظم التجريبية اليوم لتوسيع معرفتنا القلب والأوعية الدموية من المواضيع الهامة، بما في ذلك الضرر نقص التروية، ضخه 2، 4 شروط مسبقة، العلاج بالخلايا القائمة على عضلة القلب التالفة 5،7، آثار القلب المخدرات 6،9، والحفاظ على طعم خيفي القلب تقنيات 8،15-18.
في حين أن كلا نظم القلب معزولة يمكن استخدامها لأي نوع من الثدييات، وأنها تستخدم في المقام الأول على الثدييات الصغيرة، مثل خنزير غينيا، الفئران، أو أرنب 3،12،13. النماذج الحيوانية الكبيرة، مثل الخنازير والبشر، وتوفير المزيد من البيانات ذات الصلة سريريا، ولكن أقل كثيرا ما تستخدم بسبب ارتفاع التكلفة، وتقلب البيولوجية أكبر، كميات أكبر من الحلول نضح الدم، وبيكإيه قطعة من المعدات 1،12-15. وعلاوة على ذلك، وجمع البيانات هو أكثر صعوبة، وخاصة بالنسبة للقلوب العمل معزولة 1،3،12-15. نتيجة لهذه التعقيدات، ونادرا ما تستخدم النماذج القلب معزولة سريريا ذات الصلة، مما يعوق بشدة تقدم البحوث متعدية القلب والأوعية الدموية.
في محاولة لحل هذه التعقيدات، تم تعديل إعداد القلب يعمل معزولة لخلق نظام التي يمكن تكييفها بسهولة إلى قلوب من مختلف الأنواع، بما في ذلك الإنسان، إما تحت الضغط المستمر أو شروط Langendorff تدفق مستمر. تم استبدال غرفة الامتثال حمولة تلوية مع مضخة طرد مركزي لتبسيط عملية ضبط ضغط التروية في وضع Langendorff وحمولة تلوية في طريقة العمل. بدلا من المغلقة، خزان لاحتواء تغلف القلب، وهذا النظام يستخدم غرفة مفتوحة لجعل جمع البيانات أسهل، من خلال تمكين استخدام نهج transapical للتصرف القسطرة. Moreovإيه، هذا التصميم المفتوح يسمح بالوصول لتقييم تخطيط صدى القلب للقلب، فضلا عن توسيع المعلمات الفسيولوجية التي يمكن قياسها خلال هذه التجارب. وهذه التحسينات على أمل تشجيع الآخرين على استخدام هذا النظام للبحوث متعدية الحيوانات الكبيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدت Langendorff معزولة جهاز نضح القلب والعمل نموذج القلب إلى بعض الاكتشافات الأساسية في علم وظائف الأعضاء القلب، وعلم الأمراض، وعلم الصيدلة. براعة هذا النموذج يسمح للاستخدام مع مجموعة متنوعة من الأنواع في إطار مجموعة من الظروف العادية والمرضية 1-18. ومع ذلك، لا يتم استخدام نموذج القلب معزولة عادة عن الثدييات الكبيرة، وخاصة قلوب البشر، ويرجع ذلك جزئيا إلى تزايد تعقيد كل من تصميم الجهاز وجمع البيانات. وبالتالي، فإن بروتوكول الواردة في هذه الوثيقة يدل على محاولة لتحسين هذه التعقيدات التي تؤدي إلى وسيلة استنساخه نسبيا من دراسة قلوب الخنازير المعزولة.
وثمة عنصر حاسم من الإعداد لدينا هو استبدال غرفة الامتثال الشرياني / حمولة تلوية مع مضخة طرد مركزي. يسمح هذا التبادل لتعزيز السيطرة على ضغط التروية التاجية وحمولة تلوية في Langendorff والعمل سائط القلب، respectively، ويسمح هذا الإعداد إلى أن تتكيف بسهولة مع قلوب من الأحجام والأنواع المختلفة. على سبيل المثال، في هذا التصميم، ويتم إشباعها قلوب الخنازير في 40-45 ملم زئبقي، بينما يتم إشباعها قلوب البشر في 60-65 مم زئبق. ويتحقق هذا التغيير في الضغط ببساطة عن طريق ضبط إعدادات مضخة طرد مركزي؛ لا مكونات النظام يحتاج إلى تعديل جسديا. علاوة على ذلك، وضع محول الضغط داخل جذر الأبهر لمراقبة الضغوط الجذرية يتيح الانتقال السهل بين التدفق المستمر والضغط المستمر أثناء وضع Langendorff. على الرغم من أن هذا التغيير يزيل غرفة الامتثال الكلاسيكية، ومضخة طرد مركزي، من خلال السماح للتدفق ثنائي الاتجاه يحدث على أساس التدرج الضغط، قد تكون بمثابة غرفة الامتثال. مع انقباض وطرد حجم السكتة الدماغية، وتدفق إلى الوراء عبر مضخة تعمل على تقليل ضغط حمولة تلوية، والتي تحاكي مرونة الأبهر.
تصميم مفتوحة من هذا الجهاز المهم أيضا. بعد أن قلب شنقا في أحد المفتوحةالجرمية، بدلا من غرفة شبه مغلق أو قمع، ويسمح لأسهل الأجهزة للقياس الضغط الحجم. تصميم مفتوحة تتيح استخدام شق transapical لLV القسطرة التنسيب، وتجنب النهج transvalvular. النهج transvalvular هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية، وعادة ما يتطلب التنظير لتحديد المكان المناسب. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذا النهج أيضا لحث قصور الصمامات. باستخدام نهج transapical، ونحن بأمان وسهولة وضع القسطرة داخل البطين الأيسر في حين القضاء على التكاليف الإضافية والإزعاج من التنظير. تصميم مفتوحة أيضا يتيح سهولة الوصول لضربات القلب وجمع النفايات السائلة، وزيادة توسيع المعلمات الوظيفية والكيميائية الحيوية التي يمكن تقييمها في حين على هذا النظام.
تصميم مفتوحة، مع تسهيل جمع البيانات، لا تجعل تنظيم درجة الحرارة عضلة القلب أكثر صعوبة. الحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية هي واحدة من المشكلات المعروفة مع Langendorffأو يعملون نظام القلب 1،3،11،13. نظام Langendorff عادة ما تحتوي على غرفة الحرارية التي تساعد على الحفاظ على درجة حرارة مناسبة، ولكن هذا أيضا يجعل الغرفة الإدراج من البطين ضغط حجم القسطرة أكثر صعوبة. لحل تنظيم درجة الحرارة أدنى من التصميم المفتوح، وضعت على مبادل مكساج / الحرارة بعد الخزان. والحد الأدنى من الفضاء بين المبادل الحراري وقنية الأبهر يقلل من فقدان الحرارة، والتحقيق في درجة الحرارة عضلة القلب يضمن سوائية الحرارة. ويمكن أيضا استخدام الأنابيب أو تغلف مصادر التدفئة الخارجية أن تستخدم للمساعدة في التحكم في درجة الحرارة.
عنصر فريد آخر من هذا البروتوكول هو غسل الدم الذاتي من الخنازير قيد الدراسة وإعادة تشكيل ذلك مع ملحي عادي. وعلى الرغم من استخدام إما perfusates الدم الكامل أو خلايا الدم الحمراء مع زيادة مخازن بلوراني ليس من غير المألوف، فإنه لا الحاضر مع القضايا. السابق وعادة ما يتطلب حيوان المانحة، وهو ما يضيف SUBSTتكاليف antial إلى التجربة، في حين أن الأخيرة يمكن أن يكون القضايا المناعية، لأنه عادة ما يشتق من الأبقار 1،11-13 الدم. عن طريق غسل دم خنزير الأصلي نفسه، وبروتوكول يتطلب سوى حيوان واحد، وذاب القضايا المناعية. أيضا، فإن عملية الغسيل يزيل معظم الشوارد، وهذا يعني أنها يمكن التلاعب بها بسهولة في المعلمات التجريبية. أخيرا، وذلك باستخدام وحدة حفظ الدم يزيل معظم البروتينات داخل الدم، والتي هي على حد سواء ميزة وعيب هذه العملية. ميزة هي أن أي التخثر والمناعية / البروتينات المعدية تتم إزالة، وخفض احتمالات الجلطات أو التلوث. والعيب هو أن هذا الخليط لديه ضغط منخفض الجرمي، والتي يمكن أن تؤدي إلى وذمة عضلة القلب وربما فقدان وظيفة القلب مع مرور الوقت. ويمكن معالجة هذه المسألة، ولكن، من خلال إضافة الزلال أو الغروانية آخر.
ضمان أن الحجم بشكل صحيح وتم اختيارها امال والقسطرة لا يقل أهمية عن استخدام جهاز القلب العمل المناسبة. من الناحية المثالية، سيتم وضع القسطرة مع جميع الأقطاب الاستشعار داخل الفضاء البطين، مع اثنين من أقطاب الإثارة (أي الأقطاب معظم الداني) خارج مساحة البطين. إذا البطين تجويف الحيوان صغير جدا، أو التباعد بين الأقطاب هو كبير جدا، وبعد ذلك سوف جميع قطاعات لا يصلح داخل الفضاء LV. في حين أن موقع الأقطاب الإثارة يمكن تعديلها، ويمكن تجويف LV الصغيرة أيضا أن يسبب القسطرة لثني أو منحنى، مما يجعل من الصعب جمع البيانات. وبالتالي، لتحليل وظيفي من قلوب الحيوانات الكبيرة، فمن المستحسن لحجم الحيوان لا تقل عن 60 كجم. مع حيوان من هذا الحجم، والمباعدة بين القطب 7 مم وعادة ما يسمح للالإدراج كاملة من القسطرة.
في الختام، توضح هذه المخطوطة لنظام العمل القلب المعزولة التي يبسط تنظيم ضغط التروية، عمود البياناتفصل من الكتاب المقدس، والتصميم العام، في حين جعل التحكم في درجة الحرارة قليلا فقط أكثر صعوبة. وهذه التعديلات إلى قلب العمل معزولة تسمح نأمل لزيادة استخدامه مع قلوب الثدييات الكبيرة، بما في ذلك البشر، وتعزيز فهمنا للأمراض القلبية وتمكين خيارات العلاج أكثر ذات الصلة سريريا من يكتشفها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
There are no acknowledgments.
Materials
| PowerLab 16/35 with LabChart Pro | ADInstruments | PL3516/P | |
| MPVS Ultra Pressure-Volume Unit | ADInstruments | 880-0168 | |
| Ventri-Cath Catheter (5F, 12E, 7mm, DField, Straight, 122cm) | Millar | VENTRI-CATH-507s | |
| Pressure Catheter (3.5F, Single, Straight, 100cm, Ny, Non Repairable) | Millar | SPR-524 | |
| PV Extension Cable (10ft) | ADInstruments | CEC-10PV | |
| Catheter Interface Cable (10ft) | ADInstruments | PEC-10D | |
| Rho Calibration Cuvette | ADInstruments | 910-1060 | |
| MPVS Ultra BNC Cable Pack | ADInstruments | 880-0172 | |
| Autotransfusion system | Sorin | 7320000 | |
| Bowl Set with Low Volume (135 ml) Centrifuge Bowl | Sorin | 7135100 | |
| Oxygenator/Heat Exchanger | Terumo | 3CXSX18RX | |
| Perivascular flow probe | Transonic Systems | PAU Series | Size of flow probe will depend on animal size; for 60 kg pig, recommend 20 or 24 mm probe |
| Perivascular flowmeter module | Transonic Systems | TS420 | |
| Myocardial temerpature sensor | Smiths Medical | MTS-40015 | |
| 16 G 1" Regular needle | BD Inc. | 305197 | |
| 4-0 polypropylene suture (double-arm) | Ethicon | 8526H | For purse-string stitches |
| 2-0 polypropylene suture (single-arm) | Ethicon | 8833H | |
| Cable ties | ULINE | S-1021 | |
| Cable tie gun | ULINE | H-241 | |
| Clear, Flexible PVC Tubing | VWR International | 89068 | Inner diameter depends on cannulas, pumps and other equipment used; most commonly use 1/4", 3/8" tubing |
| Straight Tubing Connectors | VWR International | 46600 | |
| Y-Shaped Tubing Connectors | Thermo Scientific | 6152 | |
| Jacketed Bubble Trap | Radnoti | 14040 | For preload chamber |
| Centrifugal pump | Maquet | 70105 | The centrifugal pump and roller pumps were obtained used from perfusion department after clinical use. |
| Roller pumps | Maquet | HL-20 | |
| Hemostasis Valve | Merit Medical | MAP150 | |
| Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 570001000 |
References
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, 113-126 (2007).
- Cheung, P. Y., et al. Matrix metalloproteinase-2 contributes to ischemia-reperfusion injury in the heart. Circulation. 101, 1833-1839 (2000).
- Ytrehus, K. The ischemic heart–experimental models. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 42, 193-203 (2000).
- Ferdinandy, P., Schulz, R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. British Journal of Pharmacology. 138, 532-543 (2003).
- Ohno, N., et al. Transplantation of cryopreserved muscle cells in dilated cardiomyopathy: effects on left ventricular geometry and function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126, 1537-1548 (2003).
- Hamlin, R. L., et al. Sensitivity and specificity of isolated perfused guinea pig heart to test for drug-induced lengthening of QTc. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 15-23 (2004).
- Lee, M. S., Lill, M., Makkar, R. R. Stem cell transplantation in myocardial infarction. Reviews in Cardiovascular Medicine. 5, 82-98 (2004).
- Ryugo, M., et al. Myocardial protective effect of human recombinant hepatocyte growth factor for prolonged heart graft preservation in rats. Transplantation. 78, 1153-1158 (2004).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 171-181 (2004).
- Southworth, R., Blackburn, S. C., Davey, K. A., Sharland, G. K., Garlick, P. B. The low oxygen-carrying capacity of Krebs buffer causes a doubling in ventricular wall thickness in the isolated heart. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83, 174-182 (2005).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 597-603 (2000).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 613-627 (2000).
- Hill, A. J., et al. In vitro studies of human hearts. Ann Thorac Surg. 79, 168-177 (2005).
- Colah, S., et al. Ex vivo perfusion of the swine heart as a method for pre-transplant assessment. Perfusion. 27, 408-413 (2012).
- Ozeki, T., et al. Heart preservation using continuous ex vivo perfusion improves viability and functional recovery. Circ J. 71, 153-159 (2007).
- Garbade, J., et al. Functional, metabolic, and morphological aspects of continuous, normothermic heart preservation: effects of different preparation and perfusion techniques. Tissue engineering. Part C, Methods. 15, 275-283 (2009).
- Poston, R. S., et al. Optimizing donor heart outcome after prolonged storage with endothelial function analysis and continuous perfusion. Ann Thorac Surg. 78, 1362-1370 (2004).
