JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Published: May 17, 2014
doi:
10.3791/51455
, , , , , ,
1Lady Davis Institute and Department of Oncology,McGill University, 2Department of Oncology-Pathology,Karolinska Institutet, 3Goodman Cancer Centre and Department of Biochemistry,McGill University

Summary

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Abstract

mRNA translatie speelt een centrale rol in de regulatie van genexpressie en vertegenwoordigt de meest energie verbruiken proces in zoogdiercellen. Dienovereenkomstig wordt ontregeling van mRNA translatie als een belangrijke rol spelen in verschillende pathologische toestanden met inbegrip van kanker. Ribosomen ook gastheer chaperones, die vouwen van ontluikende polypeptiden vergemakkelijken, waardoor modulerende functie en stabiliteit van nieuw gesynthetiseerde polypeptiden. Bovendien nieuwe gegevens blijkt dat ribosomen als platform voor een repertoire van signaalmoleculen, die betrokken zijn bij een verscheidenheid van post-translationele modificaties van nieuw gesynthetiseerde polypeptiden zoals zij uit het ribosoom en / of onderdelen van translatiemachinerie. Hierin, is een bekende methode van het ribosoom fractionering met behulp van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie beschreven. In combinatie met de in eigen huis ontwikkelde "anota" algoritme maakt deze methode directe bepaling van verschilvoordrachtrechten vertaling van individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze veelzijdige protocol worden gebruikt voor een verscheidenheid van biochemische studies gericht op de functie van de ribosoom-geassocieerde eiwitcomplexen, waaronder die welke een centrale rol spelen bij vouwen en afbraak van nieuw gesynthetiseerde polypeptiden ontleden.

Introduction

De regulerende netwerken die genexpressie zijn uitgebreid bestudeerd in de laatste twee decennia. De overgrote meerderheid van deze onderzoeksinspanningen gericht op transcriptieregulatie, waarbij veranderingen in de steady-state mRNA-niveaus op een genoom-brede schaal gebruikt zogenaamde "genexpressie" profielen bepalen. Recente studies tonen aan dat steady-state mRNA-niveaus slechts losjes overeen met de samenstelling van het proteoom 1,2, waardoor wordt aangegeven dat de post-transcriptionele mechanismen, waaronder mRNA translatie, spelen een belangrijke rol in de regulatie van genexpressie 3,4. Inderdaad is geschat dat ongeveer 50% van eiwitniveaus worden bepaald op het niveau van mRNA translatie in geïmmortaliseerde muizen fibroblasten 5.

mRNA translatie is een sterk gereguleerd proces waarbij mRNA wordt vertaald in eiwitten via georkestreerde actie van ribosomen, de overdracht RNA (tRNA) en toebehoren factoren commonly genoemd translatiefactoren (TFS) 6. Eiwit synthese is de meest energie verbruikende proces in zoogdiercellen 7 en dus globale mRNA translatie tarieven worden aangepast aan de beschikbaarheid van voedingsstoffen en celproliferatie tarieven 8 tegemoet te komen. Naast veranderingen in de wereldwijde mRNA translatie tarieven, verschillende extracellulaire stimuli (bijv. hormonen en groeifactoren), intracellulaire signalen (bijvoorbeeld aminozuur levels) en de verschillende types van stress (bijvoorbeeld ER-stress) induceren selectieve veranderingen in de zwembaden van mRNA's die zijn vertaald (translatome) 6. Afhankelijk van het type stimulus, translatie activiteit van sommige, maar niet alle mRNA's sterk aangetast, hetgeen resulteert in veranderingen in het proteoom die nodig zijn om een snelle cellulaire respons 6 monteren. De kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in de translatome wordt gedacht te worden gemedieerd door de wisselwerking tussen het trans-werkende factoren (bv. </em> componenten van translationeel machines, hulp-factoren of miRNAs) en cis-elementen (RNA elementen of kenmerken) aanwezig zijn in geselecteerde subsets van mRNA 6,9. Bijvoorbeeld veranderingen in de niveaus en / of activiteit van snelheidsbeperkende translatie initiatie factoren eIF4E en eIF2 selectief moduleren vertaling van transcripten gebaseerd op de specifieke kenmerken 5'UTR 6. eIF4E en eIF2 nodig zijn voor de werving van mRNA en initiator tRNA aan het ribosoom, respectievelijk 6. Een toename van eIF4E activiteit selectief versterkt vertaling van mRNA herbergen lang en sterk gestructureerde 5'UTRs waaronder die coderen proliferatie en overleving stimulerende eiwitten, met inbegrip cyclines, c-myc en Bcl-xL 10. Op zijn beurt, inactivatie van eIF2 tot een globale eiwitsynthese uitschakeling, terwijl selectief omhoog reguleren van translatie van mRNAs met korte remmende stroomopwaartse open leesramen (uORFs) in hun 5'UTRs, zoals die welke coderen meester transcriptional regulatoren van de ongevouwen eiwit respons (bijv. ATF4). In reactie op verschillende stimuli zoals voedingsstoffen, groeifactoren en hormonen, de mechanistische / zoogdieren van rapamycine (mTOR) route stimuleert eIF4E activiteit door het inactiveren van de 4E-bindend eiwit (4E-BP) familie van de vertaling onderdrukkers, terwijl de MAPK route rechtstreeks phosphorylates eIF4E 6,11. Op zijn beurt, eIF2α kinasen (dwz PERK, PKR, HRI en GCN2) remmen eIF2 door fosforylatie haar eIF2α regulerende subunit in reactie op voedingsstoffen ontbering, ER-stress en virusinfectie 6,12. Veranderingen in de activiteit en / of expressie van TFs hebben andere componenten van de machines en translationele regulerende factoren, waaronder miRNAs waargenomen bij verschillende pathologische toestanden met inbegrip van kanker, metabole syndromen, neurologische en psychiatrische aandoeningen, en nier-en vaatziekten 13-19. Gezamenlijk geven deze gegevens aan dat translationeel mechanisms spelen een centrale rol in het behoud cel homeostase en dat afschaffing ervan een centrale rol speelt in de etiologie van verschillende ziekten bij de mens.

Hierin is een protocol voor fractionering van polysomen sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie in zoogdiercellen, die wordt gebruikt om polysomen scheiden van monosomes, ribosomale subeenheden en boodschapper ribonucleoproteïnepartikels (mRNPs) beschreven. Dit maakt onderscheid tussen efficiënt vertaald (in verband met zware polysomen) van slecht vertaald (in verband met licht polysomen) mRNA's. In deze assay worden ribosomen geïmmobiliseerd op het mRNA middels translatie rek remmers zoals cycloheximide 20 en cytosolische extracten gescheiden op 5-50% lineaire sucrose dichtheidsgradiënten door ultracentrifugatie. Daaropvolgende fractionering van sucrose gradiënten maakt isolatie van mRNA volgens het aantal ribosomen ze binden. RNA geëxtraheerd uit elke fractie kan vervolgens worden bepaaldveranderingen in de verdeling van mRNA in het verloop van verschillende omstandigheden, waarbij translationele efficiëntie toeneemt van de top naar de bodem van de gradiënt. Northern blotting of kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) worden gebruikt om niveaus van mRNA in elke fractie bepaald.

Als alternatief fracties die zware polysomen (meestal meer dan 3 ribosomen) worden samengevoegd en genoom-brede-polysome geassocieerd mRNA niveaus worden bepaald met behulp van microarray of deep-sequencing. Het is van groot belang te benadrukken dat de niveaus van polysome geassocieerde mRNA's, naast de vertaling, die door transcriptionele en post-transcriptionele mechanismen die invloed cytosolische mRNA niveau 21. Daarom verschillen in translatie door genomische gegevens uit polysome geassocieerde mRNA te bepalen, worden gecorrigeerd voor de effecten van stappen in de genexpressie weg die stroomopwaarts van vertalingen zijntie 21. Om een dergelijke correctie mogelijk is cytosolische RNA parallel bereid met polysome geassocieerde RNA van elk monster en de genoom-brede steady-state mRNA-niveaus bepaald 21. Momenteel, zogenaamde "translation-efficiëntie" (TE) score (dwz de log-verhouding tussen polysome geassocieerde mRNA databank cytosolische mRNA gegevens) worden vaak gebruikt om te corrigeren voor de effecten van veranderingen in mRNA-niveaus van cytosolisch translatie efficiëntie van een gegeven mRNA 22. Het gebruik TE scores differentiële vertaling identificeren geassocieerd met aanzienlijke aantal vals positieve en vals negatieve resultaten als gevolg van een wiskundige eigenschap van de TE scores aangeduid als valse correlatie 27. Inderdaad een overzicht van datasets van meerdere laboratoria aangegeven dat een dergelijke valse correlaties lijken onvermijdelijk te zijn bij het ​​analyseren van veranderingen in de translatomes 23. Dit leidde tot de ontwikkeling van de "analyse van differentiële tr anslation "(anota) algoritme, die niet lijdt aan bovengenoemde tekortkomingen 23. Tijdens anota-analyse een regressiemodel wordt gebruikt om maatregelen van translationele activiteit onafhankelijk van cytosole RNA niveaus ontlenen. Dergelijke maatregelen worden vervolgens vergeleken tussen condities en een statistiek wordt berekend. De gebruiker heeft de mogelijkheid van het toepassen van een variantie krimp methode, die statistische power verbeterd en dat het optreden van vals-positieve bevindingen uit onderzoeken met weinig herhalingen 24. Beduidend, werd onlangs aangetoond dat verstoringen in de translatome gefotografeerd door anota, maar niet TE scores correleren met veranderingen in het proteoom 25. Daarom is het sterk aanbevolen om anota analyse toe te passen voor de identificatie van veranderingen in de vertaling op een genoom-brede schaal. Hoewel de theoretische onderbouwing van de anota algoritme eerder 21,23,26 in detail werden besproken, hier focus ligt op hoe toe te passen in de praktijk.

ve_content "> Naast het bestuderen van veranderingen in mRNA translatie activiteit in de cel, kan het ribosoom fractionering protocol voor de isolatie en biochemisch karakteriseren en functioneel ribosoom-en-polysome geassocieerde eiwitcomplexen. Deze aanpak is succesvol ingezet in het verleden te identificeren complexen die de stabiliteit van nieuw gesynthetiseerde Polypeptiden 27 en / of betrokken zijn bij de fosforylatie van componenten van de translatiemachinerie reguleren. Deze toepassing van de polysome fractionering werkwijze wordt ook kort besproken.

Protocol

1. Sucrosegradiënt Bereiding Bereid 100 ml 60% (w / v) sucrose-oplossing in DDH 2 O. Oplossing worden gefiltreerd door een 0,22 urn filter om verstopping van de buis tijdens de fractionering stap (stap 3.5) voorkomen. Bereid 5 ml 10x sucrose gradiënt buffer: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl2, 100 ug / ml cycloheximide, 1x proteaseremmer cocktail (EDTA-free), 100 eenheden / ml RNase inhibitor. De 60% oplossing bereid zoals beschreven in stap 1.1, maken 40 ml van 5% en 50% sucrose oplossing in 1x sucrose gradiënt buffer. Gebruik de Marker blok voorzien van de gradiënt maker om de half-vol punt te markeren op elk polyallomer ultracentrifugeren buis voor gelaagdheid (6 ultracentrifuge buizen in totaal). Met behulp van de gelaagdheid apparaat voorzien van de gradiënt maker, voeg 5% sucrose-oplossing totdat de half-vol punt bereikt. Voeg vervolgens 50% sucrose-oplossing van de bodem tot de interface tussen de twee oplossingen bereikt de halve vol punt. Speciale aandacht moet worden genomen tijdens deze stap zodat hellingen zijn zo veel mogelijk, aangezien dit essentieel is voor het verkrijgen van een hoge reproduceerbaarheid (zie hieronder). Seal buizen met zonale tarief caps voorzien van de gradiënt maker en breng de afgedichte buizen naar de buis houder op de helling maker. Voer het verloop maker een lineair 5% tot 50% gradiënt verkrijgen. 6 lineaire verlopen zal in een paar minuten worden gevormd door rotatie aan hoge hellingshoek. Opmerking: sucrose gradiënten kunnen direct worden gebruikt of opgeslagen bij -80 ° C gedurende 6 maanden. 2. Isolatie en sedimentatie van polysomen Afhankelijk van het celtype, zaad cellen in 1-5 15-cm petrischaaltjes (~ 15 x 10 6 cellen) ten minste een dag vóór lyse. Op de dag van de proeven dient cellen ~ 80% confluent zijn. <!– Opmerking: Optimale confluentie is essentieel, omdat de vertaling en verspreiding tarieven zijn directproportionele 8, en daarom polysomen moeten worden geanalyseerd in actief delende cellen (dwz vertaling tarieven zullen aanzienlijk dalen in meer dan samenvloeiende cellen, terwijl lage confluentie van cellen voldoende materiaal voor verdere analyse niet kunnen voorzien). Uitzonderingen op deze regel kan worden gemaakt als bijvoorbeeld de experimentator is geïnteresseerd in het bestuderen van het effect van contact inhibitie op de vertaling. Cellen mag onder meer confluente omstandigheden gehouden te lang, aangezien dit onbedoelde gevolgen voor de translatome kunnen hebben. Als transfectie vereist, de meeste van de commercieel verkrijgbare kits hebben geen invloed polysome niveaus. Omdat op de dag van transfectie cellen 80-90% confluent moet zijn, wordt aanbevolen om cellen verspreiden 24 uur na transfectie en isoleren Polysomen 48 uur na transfectie van cellen ~ 80% confluent. Incubeer cellen met cycloheximide in een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml in kweekmedium gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2; en was de cellen tweemaal met 10 ml ijskoude 1x PBS dat 100 ug / ml cycloheximide. Cycloheximide is een vertaling rek remmer die "bevriest" ribosomen op het mRNA, waardoor voorkomen wordt dat ribosoom vandoor 20. Schraap cellen zachtjes, in 5 ml ijskoude 1x PBS met 100 ug / ml cycloheximide en verzamelen ze in een 50 ml buis. Het is belangrijk dat deze stap redelijk snel verlaten cellen op ijs gedurende langere tijd drastisch de kwaliteit van de polysome preparaat verminderen wordt uitgevoerd. Verzamel cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 425 gl hypotone buffer [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCl en 1 x proteaseremmer cocktail (EDTA-free)], voeg 5 ul van 10 mg / ml CHX, 1 ui 1 M DTT, 100 eenheden RNAse inhibitor en vortex gedurende 5 seconden gevolgd door toevoeging van 25 ui 10% Triton X-100 (eindconcentratie 0,5%) en 25 ui 10% natriumdeoxycholaat (eindconcentratie 0,5%) en vortex 5 sec. Vanwege cel zwelling, zal de hypotone buffer de plasmamembraan te verstoren, terwijl het mild reinigingsmiddel voorwaarden worden gebruikt om cytosolische en endoplasmatisch reticulum-geassocieerde ribosomen oplosbaar te maken zonder het verstoren van de nucleaire envelop. Centrifugeer lysaten bij 16.000 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C en overdracht supernatant (~ 500 pi) in nieuw voorgekoelde 1,5 ml buisje. Meet OD bij 260 nm voor elk monster met behulp van een spectrofotometer en houdt 10% van het lysaat als input die wordt gebruikt om cytosolische steady-state mRNA te bepalen. Verdun de ingang tot 750 ul in RNAse vrij H 2 O, voeg 750 ul van Trizol en flits bevriezen in vloeibare stikstof. Transfer ultracentrifugebuizen met sucrose gradiënten in pre-gekoelde rotor emmers. Verwijder 500 ul van de bovenkant van sucrose gradiënten. Pas lysates zodat ze dezelfde OD (10-2 bevatten0 OD bij 260 nm) in 500 ui lysisbuffer (beschreven in stap 2.5) en plaats ze op elke sucrose gradiënt. Opmerking: Het is belangrijk om onmiddellijk geladen lysaten op de hellingen, omdat dit kritisch zal de kwaliteit van polysome preparaten. Wegen en in evenwicht elke helling voor de ultra-centrifugeren. Centrifugeer bij 222.228 xg (36.000 rpm) gedurende 2 uur bij 4 ° C met SW41Ti rotor. Opmerking: Om sucrosegradiënten niet te verstoren, moeten de "lage" remoptie worden geselecteerd. 3. Polysome fractionering en RNA-extractie Bereid de fractie collector door het schoonmaken met warm RNAse vrij water met RNase ZAP (een paar sprays). Herhaal deze stap met alleen warm RNAse vrij water. Schakel UV-lamp en wacht op het groene licht te verschijnen. Verwijder voorzichtig buizen uit de rotor en leg ze op ijs. Schakel de computer, pomp, UV-detector en fractie verzamelaar. Stel de pomp in op 3 ml / min en fill de buis met de achtervolgende oplossing [60% (w / v) sucrose bevattende 0,02% (w / v) broomfenolblauw] totdat de naald bereikt. Zorg ervoor om te zien ten minste een druppel uit de naald, en na te gaan dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd in de pomp spuit of slang. Breng 2 ml buisjes in een fractie collector. Lanceren analyse programma en stel de gevoeligheid voor + / – 10 Mev. Stel "tijdbasis" 100 sec. Plaats elke ultracentrifugeren buis in de UV-detector terwijl ervoor te zorgen dat de buis in de orthogonale positie. Doorboren de buis met de naald door het verdraaien van de knop onder de buis houder. Stel de pomp bij 1,5 ml / min en vang de fracties instellen van de tijd 30 seconden op de fractiecollector (dit leidt tot ~ 750 ul van elke fractie). Plaats de pomp in de "remote positie", start de pomp en fractie collector, en op hetzelfde moment start de opname met behulp van de DAQ tracer. Dit zal een opwaartse verplaatsing van de sucrose gra startendient en gelijktijdige detectie van UV absorptie bij 254 nm. Stop verzamelen zodra de eerste druppel jagen oplossing valt in een 2 ml verzamelbuis. Sla de tracering in csv formaat en (eenmaal stap 3.7 is voltooid), in een spreadsheet-applicatie, het volgende doen om de positionering van elke fractie in de UV-absorptie profiel te identificeren.: Selecteer de kolom met waarden die overeenkomen met de absorptie bij 254 nm (kanaal 0). Maak een vloeiende lijn scatterplot van de absorptie. Stel de primaire eenheid van de X-as 300 (waarde verkregen door het volume van de 5% -50% sucrose gradiënt (~ 12 ml) te delen door de verzameltijd elke fractie (30 sec). Voeg 750 ul van Trizol in elke fractie en flits bevriezen de fracties in vloeibare stikstof. Isoleer-polysome geassocieerde en cytosolische (vanaf 2.6) met behulp van RNA Trizol protocol volgens de instructies van de fabrikant. RNA opbrengst te verhogen, doorgaan met RNA precisiepitation bij -80 ° C gedurende 30 minuten of -20 ° C overnacht. Opmerking: Omdat de hoeveelheid RNA neergeslagen uit polysomal fracties niet duidelijk zichtbaar zijn is het raadzaam om drager te voegen. Voeg 1 ul van de vervoerder aan de buis voor de RNA precipitatiestap tijdens de Trizol protocol. Bepaal welke fracties overeenkomen met mRNA geassocieerd met> 3 ribosoom (met behulp van aanpak beschreven 3.6) en bundelen deze fracties. Gebruik de RNA opruimen kit om opruimen van gepoolde polysome verbonden en cytosolische RNA (vanaf 2.6) uit te voeren. Monsters voorleggen aan een faciliteit om genoom-brede mRNA niveaus te bepalen met behulp van microarrays of deep-sequencing. Als translatie van specifieke mRNA moeten worden gecontroleerd door RT-qPCR wordt aanbevolen 500 ng RNA (van samengevoegde fracties die> 3 ribosomen of totaal RNA) om cDNA te synthetiseren. Opmerking: mRNA's geassocieerd met> 3 ribosomen is arbitrair efficiënt vertaald mRNA vertegenwoordigen en bevatten meer dan 80% van de nieuw gesynthetiseerdsized polypeptiden 28,29. Waaronder die overeenkwamen met licht (1-2), middel (2-3) en zware Polysomen (> 3) zou voordelig zijn, maar deze zullen aantal monsters verhogen 2-voudig (4 versus 2 per conditie) en dus de kosten van het experiment. Ondanks het feit dat verwacht wordt dat de daling van de kosten van deep-sequencing en microarray analyse in de toekomst, moet de laatste benadering te bevorderen, is het aangeraden dat tijdens de validatie, de verdeling van de individuele mRNA's wordt bewaakt in elke fractie. 4. Genoom-brede analyse van mRNA Vertaling Installeer R, Bioconductor en de anota pakket: Installeer R (download van r-project.org) en een R-sessie te starten. Opmerking: R is beschikbaar voor alle besturingssystemen en anota zal draaien op alle van hen. Installeer Bioconductor (bioconductor.org). R-code wordt geïnterpreteerd door de R-terminal (bv. de R console in Windows – die wordt gelanceerd door double klikken op de snelkoppeling R). Bioconductor wordt geïnstalleerd door typen (in het R-terminal): bron ("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite () Installeer de anota Bioconductor pakket (en de qvalue pakket dat anota vereist) door te typen (in de R-terminal): bron ("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite (c ("anota", "qvalue")) Test dat het pakket goed is geïnstalleerd en open de anota handleiding door te typen (in de R-terminal): bibliotheek ("anota") vignet ("anota") Opmerking: Extra hulp voor alle functies die worden gebruikt in de anota verpakking kan ofwel op anota webpagina (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) of met de helpfunctie binnen R. Bijvoorbeeld om hulp op de anotaPerformQc functie krijgen naar de R-terminal en soort (merk op dat dit werkt alleen wanneer de anota pakket is geladen): bibliotheek ("anota") # laadt de anota pakket ? AnotaPerformQc # opent hulp voor deze functie Gegevens importeren naar R: Bereid expressie data voor analyse. De gegevens moeten worden voorbewerkt (bijv. genormaliseerd en kwaliteitscontrole) ten opzichte van de techniek die werd gebruikt om het mRNA te meten. Input waarden moeten worden omgezet in te loggen, meest voorkomende is log2. Compileren een tabel met gegevens voor alle-polysome geassocieerde RNA monsters en een voor alle cytosolaire RNA-monsters. De eerste kolom moet het gen-identifiers, gevolgd door een data kolom per monster bevatten; de eerste rij moeten namen voor de monsters bevatten. Het is cruciaal dat de tafels hebben identieke monster orde en identieke genvolgorde. Sla de bestanden als door tabs gescheiden tekstbestanden genaamd "myPolysomeData.txt" en "myCytosolicData.txt". In dit voorbeeld twee monsters klassen worden gebruikt (controle of zieke) met 3 herhalingen per klasse, zo werden 6 monsters met deze volgorde: C1, C2, C3, D1, D2, D3 in zowel de myCytosolicData.txt en myPolysomeData.txt bestanden. Anota vereist minstens 3 replicaten per conditie als er twee klassen monster. Deze moeten onafhankelijk biologische herhalingen. Maak een map die de gegevens input-bestanden (myPolysomeData.txt en myCytosolicData.txt) bevat. Open R uit deze map. In Windows / Mac kan dit worden gedaan door het kopiëren van een R-snelkoppeling naar deze map en de lancering van R met behulp van deze snelkoppeling (het rechtstreeks werken kan ook worden gewijzigd met behulp van de drop-down menu's). Maak een bestand met de naam myCode.R binnen de nieuw aangemaakte map en open deze met behulp van een software tekstbewerking. Schrijf de code in dit bestand. Om de gegevens te laden in R schrijven de volgende code om de myCode.R bestand (vergeet niet om opnieuw te saven na elke toevoeging van code). Hieronder is een stap-voor-sTEP uitleg van de code, maar alle code zou ook in eerste instantie en de bron functie worden geschreven (dat loopt van de code, zie hieronder) gebruikt slechts een keer: # # Deze laadt de anota bibliotheek bibliotheek (anota) # # Dit laadt input data in R dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", header = TRUE, row.names = 1, september = " t")) dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", header = TRUE, row.names = 1, september = " t")) Voer de code in R door te typen in het O terminal: bron ("myCode.R") Controleer of de gegevens met succes geladen door te typen (in het O-terminal): hoofd (dataCyto) # zal de top van de dataCyto tabel geven hoofd (dataPoly) Identificatie van differentieel vertaald genen: Genereer een vector die beschrijftde categorieën monster (een vector is een type object in R). Deze vector moet het monster orde in de myPolysomeData.txt en myCytosolicData.txt weerspiegelen, zodat alle drie objecten hebben een identieke volgorde van de monsters. De vector zal worden gebruikt bij het instrueren anota over welke monsters te vergelijken. Voeg de volgende aan de myCode.R bestand: # # Merk op dat de identieke monsters hebben identieke sample klasse # # Beschrijvingen (bijv. "C" of "D") in deze vector. myPhenotypes <- c ("C", "C", "C", "D", "D", "D") Voeren kwaliteitscontrole van de dataset. Er zijn een aantal van de kwaliteit maatregelen die moeten worden beoordeeld voordat anota kan worden gebruikt voor analyse. Deze worden besproken in de anota handleiding. Voeg deze code aan myCode.R bestand en sla: anotaQcOut <- anotaPerformQc (datat = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) Voer de code door te typen in R-terminal: bron ("myCode.R") Dit zal een aantal output-bestanden, die kunnen worden onderzocht volgens de instructies in de handleiding anota genereren. Identificeer genen differentieel vertaald. Monsters worden vergeleken op basis van de alfabetische volgorde van de namen op de parameter "phenoVec" (dwz de "myPhenotypes" vector) geleverd, tenzij ze door de gebruiker (via de parameter "tegenstellingen"). Voeg de volgende code toe aan dossier en afwerking myCode.R met behulp van de "bron" commando in de R-terminal zoals hierboven beschreven: anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (datat = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) Gebruik de hulp voor anotaGetSigGenes te begrijpen hoe de output wordt geformatteerd en kijk hoe je monster categorieën kiezen om te vergelijken door te typen (in de R-terminal): ? AnotaGetSigGenes Filter en plot genen die differentieel vertaald. Er zijn meerdere drempels die kunnen worden toegepast binnen de anotaPlotSigGenes functie en het gebruik van hulp zal een aangepaste combinatie van dergelijke drempels te vereenvoudigen. Om te selecteren voor het betrouwbaar geanalyseerd genen passen de minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) en slopeP (0.01) instellingen. Opmerking: Naast, instellingen van toepassing zijn op RVM 23,26,30 valse ontdekking tarief (FDR) (0.15) en veranderingen vouw (log2 [1.5]) kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om differentieel vertaald genen te identificeren. Andere filters zoals "selDeltaPT" kan nuttig zijn voor een strenger filtering (bijvoorbeeld tot vaststelling selDeltaPT om LOG2 [1.5]) zijn. Het is ook noodzakelijk om te specificeren welke vergelijking moet worden gefilterd (met behulp van de selCont argument). Breng de beschreven instellingen door het toevoegen van de volgende regel aan de myCode.Rfile: anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) Voer de analyse met de bron functie van de R-terminal zoals hierboven beschreven. Dit zal ook leiden tot een grafische weergave. Het onderzoeken van deze uitgang is een goed uitgangspunt om de prestaties van de analyse te beoordelen en de nodige wijzigingen in de instellingen. Genereer een uitgang tafel. Voeg de volgende code aan de myCode.R bestand: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", september = " t") Voer de code met de bronfunctie in de R-terminal. De kolommen in de resulterende tabel worden toegelicht in de hulp voor de anotaPlotSigGenes functie.

Representative Results

mTOR is een belangrijk knooppunt van het mobiele netwerk dat de wereldwijde eiwitsynthese tarieven coördineert met de beschikbaarheid van voedingsstoffen 19. mRNA translatie wordt voornamelijk geregeld op de snelheidsbeperkende initiatie stap 6. Het aandeel van de ribosomen die zich bezighouden met polysomen positief correleert met translatie-initiatie tarieven 28. Een voorbeeld van toepassing van de polysome fractionering methode om de rol van mTOR signalering in het mediëren de effecten van insuline op mRNA translatie onderzoeken gepresenteerd. Hiertoe werden humane MCF7-borstkankercellen onderhouden lage serum en vervolgens gestimuleerd met insuline alleen of in combinatie met de actieve plaats mTORinhibitor Torin1. Niet-gestimuleerde cellen die continu werden bewaard in lage serum, diende als controle. mRNPs, monosome (80S) en polysome fracties werden gescheiden met behulp van de polysome fractioneringsmethode. Ten opzichte van de controle cellen, insuline induceerde een toename van absorptie gradiënt die overeenkwamenom polysomen, samen met een gelijktijdige verlaging van absorptie in de monosome fractie (figuur 1). Deze bevindingen tonen aan dat het percentage ribosomen bezig polysomen wordt verhoogd insuline worden vergeleken met controle cellen, hetgeen wijst dat, zoals verwacht, insuline stimuleert globale translatie initiatie tarieven. Torin1 keerde de effecten van insuline op absorptie profielen (figuur 1), waarbij de bevestigende bevindingen dat mTOR signalering speelt een belangrijke rol in het mediëren van de effecten van insuline op de translatie 19. Op basis van een principe dat inconsistenties gradiënt preparaat niet te vermijden zijn vragen gerezen over de reproduceerbaarheid van de verkregen met de polysome fractioneringsmethode 22 gegevens. Om deze potentieel schadelijke kwestie, cytosolische en zware-polysome geassocieerde RNA (mRNA geassocieerd met 4 en meer ribosomen) empirisch te toetsen werden geïsoleerd van MCF7 cellen behandeld met insuline alleen of in combinatie met insuline Torin1 van 4 onafhankelijke biologische replicaten (figuur 2). De effecten van insuline en Torin1 de samenstelling van cytosolische en zware polysome geassocieerde mRNA in elke duplo bepaald op een genoom-schaal met een microarray benadering. Om de reproduceerbaarheid van de polysome fractioneringsmethode de principale componenten analyse (PCA) werd toegepast bepalen. Deze analyse toonde aan dat de monsters die van elke conditie werden stevig gepositioneerd binnen de eerste twee onderdelen terwijl de verschillende omstandigheden goed gescheiden waren (figuur 2). Deze bevindingen tonen aan dat de polysome fractioneringsmethode zoals hier beschreven is zeer reproduceerbaar en daarom worden kwantitatieve en kwalitatieve veranderingen in de vertaling op een genoom-brede niveau te bestuderen. ad/51455/51455fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/> Figuur 1. Polysomal profielen waarin de effecten van serum verhongering, insuline en mTOR signalisatie op wereldwijde vertaaldiensten in MCF7 cellen. MCF7 cellen werden beroofd van voedingsstoffen (gehandhaafd in 0,1% FBS) gedurende 16 uur en behandeld met 5 nM insuline (Ins) alleen of in combinatie met 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) gedurende 4 uur. Onbehandelde cellen die continu werden ontnomen nutriënten (0,1% FBS) werden gebruikt als controle. De overeenkomstige cytosolische extracten werden gecentrifugeerd op 5-50% sucrose gradiënten. Gratis ribosomale subeenheden (40S en 60S), monosomes (80S) en het aantal ribosomen in de polysome fracties worden aangegeven. Figuur 2. Genome-wide data verkregen met behulp van polysome profileren zeer reproduceerbaar. MCF7-cellen werden behandeld zoals in figuur 1. cytosolische en polysome geassocieerde RNA (> 3 ribosomen) werd uit 4 onafhankelijke biologische replicaten en hun genoom-brede mRNA-niveaus werden bepaald met GeneTitan arrays (Affymetrix). PCA werd gebruikt om de reproduceerbaarheid van de verkregen gegevens te beoordelen. Getoond zijn de eerste twee PCA componenten voor alle behandelingen (T1 = Torin 1; ctrl = controle; Ins = insuline), oorsprong van RNA (C = cytosole, P =-polysome geassocieerd) en repliceert. Monsters van dezelfde staat en RNA oorsprong zijn nauw gepositioneerd aangeeft hoge reproduceerbaarheid.

Discussion

Dit artikel beschrijft een gevestigde polysome fractionering protocol gevolgd door een in-house ontwikkelde analysemethode voor het vastleggen van kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in de translationele activiteit op een genoom-brede schaal in zoogdiercellen. Voor een succesvolle afronding van dit protocol dient speciale aandacht te worden besteed aan 1) Mobiele confluentie (zoals de proliferatie prijzen en beschikbaarheid van voedingsstoffen correleren met mRNA translatie activiteit en kan de samenstelling van de translatome beïnvloeden, cel confluentie moet consistent replica's en experimentele omstandigheden zijn), 2) snelle lysis (Niettegenstaande de aanwezigheid van cycloheximide en RNAse-remmers in buffers moeten lysis snel en cellulaire fragmenten worden gevuld op sucrosegradiënten onmiddellijk na lysis RNA degradatie en dissociatie van polysomen voorkomen), 3) Gradient preparaat (te zorgen hoge data reproduceerbaarheid, moet sucrosegradiënten worden bereid met de gradiënt maker en speciële zorg moeten worden genomen bij de omgang met hen).

Naast het bestuderen van de veranderingen in de translationele activiteit kan dit protocol worden gebruikt ribosoom-geassocieerde eiwitcomplexen isoleren en hun fysiologische functies stellen. Hiertoe kunnen niveaus en fosforylatie status van verschillende ribosoom-geassocieerde eiwitten bepaald door TCA precipitatie, gevolgd door Western blotting, terwijl ribosoom-geassocieerde eiwitcomplexen kunnen worden geïmmunoprecipiteerd uit gradiënt fracties en door Western blotting of massa-spectrometrie geanalyseerd. Een nadeel van deze techniek is dat de langzame gradiënt fractie methode kan leiden tot dissociatie van zelfs sterk gebonden eiwitten waarvan bindingskinetiek in snelle associatie / dissociatie. Factoren geassocieerd met nieuw gesynthetiseerde polypeptiden zijn typische voorbeelden. Nieuw gesynthetiseerde polypeptiden opkomende vormen de ribosomen kan worden geïmmobiliseerd op eiwitcomplexen verbonden ribosomen behulp van chemische cross-linkers zoals 3, 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Deze benadering bleek de receptor geactiveerd kinase C 1 (RACK1) / c-Jun-N-terminale kinase (JNK) / eukaryotische translatie elongatie factor 1A2 (eEF1A2) complex regelt afbraak van nieuw gesynthetiseerde polypeptiden in reactie op stress 27. Bovendien werd soortgelijke methodologie gebruikt in studies aantonen dat de proteïne kinase C bii (PKCbII) wordt gerekruteerd door ribosomen RACK1 32 en activering van mTOR complex 2 (mTORC2) gebeurt op de ribosomen waar fosforyleert nieuw gesynthetiseerde AKT polypeptiden en regelt de stabiliteit 33,34.

Belangrijke beperkingen van de polysome fractionering methode die anota analyse: 1) vereiste van een relatief groot aantal cellen (~ 15 x 10 6 cellen), 2) het ontbreken van positionele informatie met betrekking tot lokalisatie van ribosoom op een bepaalde mRNA molecuul en 3 ) kwesties in verband met cellulaire en moleculaire heterohomogeniteit van normale en tumorweefsels. Problemen bij het ​​vereiste aantal cellen kan worden opgelost door aanpassing absorptiespectra pieken die overeenkomen met monosomes (80S) van cellen waarvan bedragen beperkend die met een hoge overvloed cellen (bijv. HeLa cellen) 35. Ribosoom profileringstechniek (zie hieronder) kan worden gebruikt om de exacte positie van het ribosoom op een bepaalde mRNA-molecuul te bepalen, terwijl problemen in verband met verstorende effecten weefsel heterogeniteit op de interpretatie van veranderingen in genexpressie verkregen uit complexe systemen zoals menselijke weefsels besproken in detail beschreven in een publicatie van Leek en Storey 36.

Onlangs is een nieuwe ribosoom profilering techniek ontwikkeld, waarbij ribosoom beschermde fragmenten (RPFs) worden gegenereerd door RNAse I behandeling en diep-sequencing 22 geanalyseerd. Deze techniek maakt de bepaling van het ribosoom positie een nucleotide resolutie, waardoor dusver unprecedented inzichten in ribosoom biologie. Bijvoorbeeld kan ribosoom profilering worden gebruikt voor de bepaling van de dichtheid ribosoom op een bepaalde mRNA-molecuul of de identificatie van elementen die invloed translatie initiatie tarieven zoals subsidiair initiatieplaatsen, initiatie op niet-AUG codons en regulerende elementen zoals uORFs. Er zijn echter verscheidene methodologische beperkingen die het vermogen van ribosoom profilering te schatten mRNA translatie-efficiëntie beperken. Deze omvatten onafhankelijke vooroordelen geïntroduceerd door willekeurige fragmentatie en RNase digestie, vooroordelen geïntroduceerd door remmers (bijv. rek remmers zoals emetine en cycloheximide waarschijnlijk ophoping ribosoom translatie initiatie plaatsen induceren), een groot aantal vals positieve en vals negatieve resultaten in verband met TE scoort evenals de onnauwkeurigheid bij het ​​voorspellen van de leest die afkomstig zijn van eiwit-coderende mRNAs 37. Misschien wel het allerbelangrijkste, terwijlribosoom profilering maakt directe identificatie van ribosoom positie op een bepaalde mRNA-molecuul, wordt het aantal ribosomen die is gekoppeld aan een bepaalde mRNA indirect geschat door het normaliseren frequenties van leest RPFs (ribosoom-geassocieerde mRNA) dan die waargenomen bij willekeurig gefragmenteerd mRNA (totaal mRNA). Bijvoorbeeld, in een eenvoudige omgeving waar vier "B" mRNA-moleculen (Ba, Bb, Bc en Bd) bezet door vier ribosomen op de posities 1, 2, 3 en 4, een inherente tekortkoming van de ribosoom profilering techniek zal niet toestaan onderscheid tussen een scenario waarin alle 4 ribosomen associëren alleen een Ba mRNA op posities 1, 2, 3 en 4 en een scenario waarin Ba, Bb, Bc en Bd mRNA elk ingenomen door een ribosoom op positie 1, 2 , 3 en 4 respectievelijk. Daarentegen, tijdens polysome fractionering wordt polysome integriteit bewaard, waardoor isolatie van pools van mRNA's geassocieerd met een bepaald aantal ribosomen (Figuur 1). Deze importmier onderscheid tussen polysome fractionering en ribosoom profilering suggereert dat terwijl de eerste methode kan worden gebruikt om direct mRNA's vergelijken in mRNP, lichte en zware polysome fracties, de laatste methode zal waarschijnlijk mislukken van veranderingen in de translatome die worden veroorzaakt door mRNA's vast te leggen dat de overgang van lichte tot zware polysomen, terwijl overschatting van de bijdrage van degenen die verschuiven van de mRNP fractie aan zware polysomen. De biologische relevantie van de verschillen tussen de voornoemde werkwijzen wordt onderstreept door een grote hoeveelheid gegevens blijkt dat translationele activering van een subset van mRNA zoals die eIF4E gevoelig zijn overgang van licht naar zwaar polysomen, terwijl andere, zoals herbergen 5'TOP elementen, worden gerekruteerd voor zware polysomen rechtstreeks van pools van ribosoom gratis mRNA 6. Interessant is de mTORweg aangetoond dat gelijktijdig moduleren vertaling van "eIF4E-gevoelige" en 5'TOP mRNAs 11. Derhalve methodologische verschillen die hierboven besproken kan de schijnbare discrepantie van de sluiting tussen studies met ribosoom profilering 38,39 en polysome fractionering 24 de effecten van mTOR inhibitie op translatome beoordelen verklaren.

Concluderend polysoom fractionering en ribosoom profilering zijn complementair methoden die vooral informatie verstrekken over het aantal ribosomen geassocieerd met mRNA en de positie van het ribosoom op mRNA, respectievelijk. Belangrijk is dat, ondanks de tekortkomingen en voordelen van deze methoden, blijft het van essentieel belang dat de genoom-brede gegevens verkregen door beide procedures adequaat worden geanalyseerd en functioneel en biochemisch gevalideerd.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door de Canadese Institutes of Health Research subsidie ​​(CIHR MOP-115195) en FRQ-S naar IT, die ook een ontvanger van CIHR Young Investigator Award; en de Zweedse Research Council en de Zweedse Cancer Society om OL

Materials

HEPES Biobasic HB0264
MgCl 2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
Equipments
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
Buffers
10X buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).
  3. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  4. Komili, S., Silver, P. A. Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).
  5. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  6. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  7. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).
  8. Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells. J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).
  9. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  10. De Benedetti, A., Graff, J. R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).
  11. Roux, P. P., Topisirovic, I. Regulation of mRNA translation by signaling pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  12. Ron, D., Harding, H. P. Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  13. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).
  14. Proud, C. G. mTOR Signalling in Health and Disease. Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).
  15. Topisirovic, I., Sonenberg, N. mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).
  16. Pavitt, G. D., Proud, C. G. Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).
  17. Abe, M., Bonini, N. M. MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact. Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).
  18. Kasinath, B. S., et al. Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).
  19. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
  23. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. Identification of differential translation in genome wide studies. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).
  24. Larsson, O., et al. Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).
  25. Colman, H., et al. Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection. J Virol. 87, 6668-6677 (2013).
  26. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).
  27. Gandin, V., et al. Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2. Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).
  28. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).
  29. Gierer, A. Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis. J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).
  30. Wright, G. W., Simon, R. M. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).
  31. Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).
  32. Grosso, S., et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1. Biochem J. 415, 77-85 (2008).
  33. Oh, W. J., et al. mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide. EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).
  34. Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. Activation of mTORC2 by association with the ribosome. Cell. 144, 757-768 (2011).
  35. Bjur, E., et al. Distinct translational control in CD4+ T cell subsets. PLoS Genet. 9, e13 (2013).
  36. Leek, J. T., Storey, J. D. Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis. PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).
  37. Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Cell. 154, 240-251 (2013).
  38. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485, 55-61 (2012).
  39. Thoreen, C. C., et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485, 109-113 (2012).

Tags

MRNA TranslationTranslatomeRibosomePolysomeSucrose Density Gradient CentrifugationAnota AlgorithmGenome-wide AnalysisProtein FoldingPost-translational Modifications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image