ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

1。ショ糖勾配の準備 60％を100mlのddH 2 O中（w / v）のスクロース溶液を調製溶液を分画工程（工程3.5）の間にチューブの目詰まりを防止するために、0.22μmのフィルターを通して濾過されるべきである。 200のHEPES（pH7.6）中、1MのKCl、50のMgCl 2、100μg/ mlのシクロヘキシミド、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル（EDTAフリー）、100単位/ mlのRNase阻害剤：5ミリリットル10倍のショ糖勾配バッファを準備します。 工程1.1に記載のように調製した60％溶液を用いて、40 mlの5％および1×ショ糖勾配緩衝液中の50％ショ糖溶液を作る。 （計6超遠心管を）重ね着にそれぞれポリアロマー超遠心管の上半分のフルポイントをマークするために、勾配メーカーを備えたマーカーブロックを使用してください。それはハーフフルポイントに到達するまでの勾配メーカーを備えた積層装置を用いて、5％のスクロース溶液を添加する。次いで、INTERFまで底から50％スクロース溶液を添加2解の間のACEはハーフフルポイントに到達した。勾配が可能な限り類似であるように、これは、高い再現性を得るために必須であるような特別な注意が（下記参照）、このステップの間に取られるべきである。 勾配メーカーが提供率帯状キャップでチューブを密封し、勾配メーカーにチューブホルダーに密封されたチューブを移す。 リニア5％〜50％の勾配を得るために、勾配メーカーを実行します。 6線形勾配は、高傾斜角で回転することにより、数分で形成される。 注：スクロース勾配は6ヶ月間、直ちに使用するか、または-80℃で保存することができる。 2。単離とポリソームの沈降細胞型、種子細胞1-5 15cmのペトリ皿（〜15×10 6細胞）へによっては少なくとも一日前に溶解。実験の日に、細胞は約80％コンフルエントにする必要があります。 <!–注：翻訳と増殖率が直接であるため、最適な細胞集密度は非常に重要です8比例するのでポリソームが活発に増殖している細胞に分析すべきである（細胞の低集密度は、さらなる分析のために十分な材料を提供しないかもしれないのに対して、 すなわち換算レートが大幅にコンフルエント細胞の上に減少します）。例えば実験者が翻訳上の接触阻害の効果を研究に興味を持っている場合は、この規則の例外は作ることができる。これはtranslatomeに不注意影響を与えることがあるしかし、細胞は、あまりにも長い間にわたる融合性条件下に維持すべきではありません。 トランスフェクションが必要な場合は、市販のキットのほとんどはポリソームのレベルに影響を与えない。トランスフェクション細胞の日に80〜90％コンフルエントでなければならないので、それが約80％コンフルエントの細胞を24時間後にトランスフェクションを伝播し、細胞からポリソームの48時間後、トランスフェクションを隔離することをお勧めします。 37℃および5で5分間、増殖培地中の100μg/ mlの最終濃度でシクロヘキシミドで細胞をインキュベートする％のCO 2;および100μg/ mlのシクロヘキシミドを含む氷冷した1×10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。シクロヘキシミド、それによって20をオフに実行リボソームを防ぐ、mRNA上のリボソームを「フリーズ」と翻訳伸長阻害剤である。 100μg/ mlのシクロヘキシミドを含む氷冷した1×PBS 5mlに、静かに細胞をこすり落とし、50ミリリットルチューブにそれらを収集。なお、この工程は大幅にポリソーム調製物の品質を低下させる長期間氷上で細胞を残すような適度に速く実行されることが重要である。 4℃で5分間、200×gの遠心分離によって細胞を収集する / [MM KClおよび1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル（EDTAフリー）1.5、（5 mMトリス-塩酸（pH7.5）、2.5のMgCl 2]低張性緩衝液の425μlの上清を再懸濁細胞を廃棄し、10mgを5μlを加えるミリリットルCHX、10パーセントTritoの25μlを加え、続いて5秒間、1 M DTT、RNase阻害剤と渦の100単位の1μLN X-100（最終濃度0.5％）と10％デオキシコール酸ナトリウムを25μl（最終濃度0.5％）と5秒間ボルテックス。中性洗剤条件は核膜を破壊することなく細胞質ゾルおよび小胞体関連リボソームを可溶化するために使用されているのに対し、セルの膨張を、低張緩衝液は、原形質膜を破壊するであろう。 4℃で7分間の16,000×gで遠心分離溶解物および新しい予備冷却1.5ミリリットルチューブに上清（〜500μl）を移す。分光光度計を用いて、各試料について260nmでのODを測定し、細胞質ゾルの定常状態のmRNAレベルを決定するために使用される入力として、溶解物の10％を維持する。 RNA分解酵素フリーのH 2 O中750μlに入力を希釈、液体窒素中で750のTrizolμLとフラッシュ凍結を追加します。 あらかじめ冷却ローターバケット中のスクロース勾配を含む超遠心管に移します。ショ糖勾配の上から500μLを削除します。彼らは、同じ外径（10月2日を含むよう溶解液を調整溶解バッファー500μlの260 nmで0 OD）（ステップ2.5で説明）、各ショ糖勾配上にロードします。 注意：これは批判的ソーム製剤の品質を向上させるように、すぐに、勾配に溶解物をロードすることが重要です。 秤量し、超遠心前に、各勾配のバランスをとる。 SW41Tiローターを使用して、4℃で2時間222228×gで（36,000 rpm）で遠心する。 注：スクロース勾配を崩壊させないために、「低」、ブレーキオプションが選択されるべきである。 3。ポリソーム分画およびRNA抽出のRNase ZAP（数スプレー）を含む暖かいアーゼフリーの水で洗浄することにより、フラクションコレクターを準備します。唯一の暖かいRNA分解酵素を含まない水で、この手順を繰り返します。 UVランプを切り替え、緑色のライトが表示されるのを待ちます。 慎重にローターからチューブを取り外し、氷の上に置きます。コンピュータ、ポンプ、UV検出器、およびフラクションコレクターのスイッチをオンにします。 3ミリリットル/分とFILに設定ポンプlでは、針に達するまで追跡用溶液[60％（w / v）の0.02％を含有するスクロース（w / v）のブロモフェノールブルー]を有するチューブ。針から出てくる少なくとも1滴を見たり、気泡がポンプ、シリンジやチューブ内に導入されないことを確認してください。 フラクションコレクターに2ミリリットルのチューブを配置します。解析プログラムを起動して、+ /に感度を設定 – 10 MEV。 100秒に「タイム」を設定します。 管が直交位置にあることを確認しながら、UV検出器に各超遠心チューブを置きます。チューブホルダー下のつまみをひねって針でチューブに穴を開け。 1.5ミリリットル/分でポンプを設定し、（これは各画分〜750μLになります）、フラクションコレクターに30秒までの時間を設定する画分を収集します。 「離れた位置」にポンプを入れ、ポンプおよびフラクションコレクタを起動すると同時にDAQトレーサーを使用して録音を開始する。これは、スクロースGRAの上方への変位を開始しますdientおよび254nmでのUV吸光度を同時に検出する。とすぐに解決策を追いかけての最初のドロップは、捕集管2ミリリットルに落ちるように収集を停止。 。csv形式でトレースを保存し、（一回3.7が終了した段階）、スプレッドシートアプリケーションでは、UV吸収プロファイルで各分画の位置を識別するために、次の手順を実行します。 254 nmの吸光度に対応する値を含む列を選択します（チャネル0）。 吸光度の滑らかなラインの散布図を作成します。 300 X軸の目盛間隔を設定し（各画分（30秒）の収集時間、5％〜50％スクロース勾配（〜12ml）中の容積で除した値。 各画分中のTrizol 750μLを加え、フラッシュ液体窒素中での分画を凍結する。 製造業者の説明書に従ってトリゾールプロトコルを使用してポリソーム関連及び細胞質ゾル（2.6）からRNAを単離する。 RNAの収量を増加させるために、RNA PRECIを続行30分または-20℃で一晩-80℃でpitation。 注：ポリソーム画分から沈殿したRNAの量がはっきりと表示されない場合がありますので、それがキャリアを追加することをお勧めします。トリゾールプロトコル中のRNA沈殿工程の前にチューブにキャリアの1を添加する。 （アプローチは3.6を用いて説明した）> 3リボソームに関連するmRNAに対応する画分を決定し、これらの画分をプールする。 （2.6から）をプールソーム関連および細胞質RNAのクリーンアップを実行するために、RNAのクリーンアップキットを使用してください。マイクロアレイまたはディープシークエンシングを使用してゲノムワイドなmRNAレベルを決定するために、施設にサンプルを提出する。 特定のmRNAの翻訳は、RT-qPCRにより監視される必要がある場合には、cDNAを合成し（> 3リボソームまたは全RNAを含むプールされた画分から）RNA 500ngのを使用することをお勧めします。 注：> 3リボソームに関連するmRNAを効率的に翻訳されたmRNAを表現し、新たにシンセサイザーの80％以上を含むように任意に設定されているサイズのポリペプチド28,29。光（1-2）に対応する画分を含む、媒体（2-3）及び重ポリソーム（> 3）が有利であろうが、これらは2倍のサンプル数を増加させる（条件当たり2対4）、従って実験の費用。それは将来、ディープシーケンシング、マイクロアレイ解析のコストの減少は、後者のアプローチを支持しなければならないことが予想されていることにもかかわらず、それは、検証中に、個々のmRNAの分布は各分画で監視されていることをお勧めします。 mRNAの翻訳4。ゲノムワイド解析 ：R、BioConductorのとanotaパッケージをインストール R（R-project.orgからダウンロード）をインストールして、R-セッションを開始します。 注：Rは、すべてのオペレーティングシステムで利用可能で、anotaはそれらのすべてで実行されます。 BioConductorの（bioconductor.org）をインストールします。 DOによって起動される- Rコードは、WindowsでのR端子（ 例えば 、Rコンソールから解釈されますUBLE）Rのショートカットをクリックする。バイオコンダクターは、（R端子に）入力することでインストールされます。 ソース（「http://bioconductor.org/biocLite.R」） biocLite（） （R端子に）入力してanotaのBioConductorのパッケージ（とanotaが必要とするのqvalueパッケージ）をインストールします。 ソース（「http://bioconductor.org/biocLite.R」） biocLite（C（「anota "、" qvalueを "）） パッケージが正常にインストールされ、（R端子に）入力してanotaマニュアルを開いていたことをテスト： ライブラリ（「anota」） ビネット（「anota」） 注意：anotaパッケージで使用されるすべての機能のための追加のヘルプがanotaのWebページ（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html）または使用するか見つけることができるたとえばR.内のヘルプ機能は、anotaPerformQc機能に関するヘルプを表示するには、R-TEに行くrminalと種類（anotaパッケージがロードされている場合にのみ動作することに注意してください）​​： ライブラリ（「anota "）＃はanotaパッケージをロードする ？anotaPerformQc＃この関数のヘルプを開きます Rへのデータのインポート： 分析のための発現データを準備します。データは、mRNAレベルを測定するために使用した手法に対して（ 例えば、正規化および品質制御）前処理されるべきである。 LOG2は入力値がログに記録、変換する必要がある最も一般的です。すべてのポリソーム関連RNAサンプルと、すべての細胞質ゾルのRNAサンプルのための1のためのデータで1テーブルをコンパイルします。最初の列は、サンプルあたり1データ列に続く遺伝子の識別子が含まれている必要があり;最初の行はサンプルのための名前が含まれている必要があります。これは、表が同一のサンプル順序と同一の遺伝子順序を持っていることが重要です。 「myPolysom​​eData.txt」と「myCytosolicData.txt」と呼ばれるタブ区切りのテキストフ​​ァイルとしてファイルを保存します。 この例では2つのサンプルクラス（コントロールまたは疾患）に使用される3により、この順に6つのサンプルを生成し、クラスごとに複製：myCytosolicData.txtとmyPolysom​​eData.txtファイルの両方でC1、C2、C3、D1、D2、D3。 2つのサンプルのクラスが存在する場合にAnota条件ごとに少なくとも3回の反復を必要とします。これらは独立した生物学的複製である必要があります。 データ入力ファイル（myPolysom​​eData.txtとmyCytosolicData.txt）を含むディレクトリを作成します。このディレクトリからのオープンR。 Windowsの/ Mac用には、これは（も、ドロップダウンメニューを使って変更することができます直接作業）このディレクトリに、R-ショートカットをコピーし、このショートカットを使用してRを起動して行うことができます。 新しく作成したディレクトリ内myCode.Rというファイルを作成し、テキスト編集ソフトウェアを使用して開きます。このファイルにコードを記述します。 Rにデータをロードするには（コードの各添加後に再度保存このファイルに覚えている）myCode.Rファイルに次のコードを記述します。以下のステップ·バイ·sであり、TEPコードの説明が、すべてのコードも最初に書くこともできますし、ソース関数（つまり、コードを実行し、以下を参照）、一度だけ使用される。 ＃＃これはanotaライブラリをロードするライブラリ（anota） ＃＃これはRに入力されたデータをロードする dataCyto < – as.matrix（read.tableを（「myCytosolicData.txt」、ヘッダ= TRUE、row.names = 1、9月= " tを"）） dataPoly < – as.matrix（read.tableを（「myPolysom​​eData.txt」、ヘッダ= TRUE、row.names = 1、9月= " tを"）） R端子に直接入力することでRのコードを実行します。 ソース（「myCode.R」） データは（R端子に）入力することで正常にロードされたことを確認します。 ヘッド（dataCyto）第dataCytoテーブルの上に表示されますヘッド（dataPoly） 差別的翻訳遺伝子の同定： 説明してベクトルを生成サンプルカテゴリー（ベクトルは、R内のオブジェクトの型である）。すべての3つのオブジェクトは、サンプルの同一の順序を持​​っているように、このベクターはmyPolysom​​eData.txtとmyCytosolicData.txtでのサンプル順序を反映する必要があります。サンプルは比較するかについてanotaを指示する際、ベクターが使用されます。 myCode.Rファイルに以下を追加します。 ＃＃複製サンプルが同一のサンプルクラスを持っていることに注意してくださいこのベクトルの＃＃記述（ すなわち、「C」または「D」）。 myPhenotypes < – てc（ "C"、 "C"、 "C"、 "D"、 "D"、 "D"） データセットの品質管理を行う。 anotaが分析に使用する前に評価する必要がある品質測定の数があります。これらは、anotaマニュアルに詳細に議論される。 myCode.Rファイルに次のコードを追加して保存します。 anotaQcOut < – anotaPerformQc（DATAT = dataCyto、DATAP = dataPoly、phenoVec = myPhenotypes） anotaResidOut < – anotaResidOutlierTest（anotaQcObj = anotaQcOut） R端子に入力することで、コードを実行します。 ソース（「myCode.R」） これはanotaマニュアルの指示通りに調べることができ、出力ファイルの数を生成します。 差別的翻訳遺伝子を同定。サンプルは、彼らが（「コントラスト」パラメータを使用して）、ユーザが指定されていない限り（「myPhenotypes「ベクターIE）」phenoVec」パラメータに指定する名前のアルファベット順に基づいて比較されます。上記のようにR端子内部の "ソース"コマンドを使用して、ファイルや仕上げをmyCode.Rに次のコードを追加します anotaSigOut < – anotaGetSigGenes（DATAT = dataCyto、DATAP = dataPoly、phenoVec = myPhenotypes、anotaQcObj = anotaQcOut） anotaGetSigGenesを理解するためのヘルプを使用してどのようにOutputなどはフォーマットされ、（R端子に）入力して比較するために、サンプルカテゴリを選択する方法を参照してくださいされています。 ？anotaGetSigGenes 差動で換算されているフィルタとプロットの遺伝子。 anotaPlotSigGenes関数内で適用することができ、助けを使用すると、このようなしきい値のカスタムの組み合わせを簡素化する複数のしきい値があります。確実に分析された遺伝子を選択するために、最小傾斜（-0.5）、最大傾斜（1.5）とslopeP（0.01）設定を適用します。 注：また、RVM 23,26,30偽発見率（FDR）（0.15）に適用設定とは、（LOG2する[1.5]）は、例えば示差的翻訳された遺伝子を同定するために使用することができる倍率変化。このような「selDeltaPT」など、他のフィルタは、（ 例えば、[1.5]をLOG2するselDeltaPTの設定）より厳格なフィルタリングのために役立ちます。これは、（selCont引数を使用して）、濾過すべき比較を指定することも必要である。 myCode.Rに次の行を追加することで説明する設定を適用しますファイル： anotaSigFiltered < – anotaPlotSigGenes（anotaSigObj = anotaSigOut、selContr = 1、最小傾斜=（-0.5）、最大傾斜= 1.5、slopeP = 0.01、maxRvmPAdj = 0.15、minEff = LOG2（1.5）、selDeltaPT = LOG2（1.5）） 上記のようにR-端末からソース関数を用いて解析を行う。これはまた、グラフィカルな出力を生成します。この出力を調べると、分析の性能を評価し、設定に必要な変更を特定するための良い出発点である。 出力テーブルを生成します。 myCode.Rファイルに次のコードを追加します。 はwrite.table（anotaSigFiltered $ selectedRvmData、ファイル= "MySignificantGenes.txt"、9月= " tを"） R端子にソース関数を使用してコードを実行します。結果のテーブル内の列がanotaPlotSigGenes機能のヘルプで説明されています。