Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Alicia Jago; Tewa Kpulun; Kathleen M. Raley-Susman; Jenny Magnes

doi:10.3791/51424

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Engineering

Longueur d'onde unique Ombre d'imagerie de Caenorhabditis elegans Locomotion y compris la force des dépenses

Published: April 18, 2014

doi:

10.3791/51424

Alicia Jago¹, Tewa Kpulun¹, Kathleen M. Raley-Susman², Jenny Magnes¹

¹Physics and Astronomy Department,Vassar College, ²Biology Department,Vassar College

Summary

La technique présentée ici mesure le chemin de nager librement espèces microscopiques en utilisant l'exposition seule longueur d'onde. C. elegans sont utilisés pour démontrer l'imagerie de l'ombre comme une alternative peu coûteuse à des microscopes coûteux. Cette technique peut être adaptée pour accueillir diverses orientations, milieux et des espèces à mesurer la direction, la vitesse, l'accélération et les forces.

Abstract

Cette étude montre une technique peu coûteuse et simple qui permet la mesure des propriétés physiques telles que la position, la vitesse, l'accélération et les forces impliquées dans le comportement locomoteur des nématodes en suspension dans une colonne d'eau en réponse à des longueurs d'onde uniques de la lumière. Nous démontrons comment évaluer la locomotion d'un organisme microscopique en utilisant Longueur d'onde unique Ombre Imaging (SWSI) en utilisant deux exemples différents.

Le premier exemple est une étude systématique et statistiquement viable de la descente moyenne de C. elegans dans une colonne d'eau. Pour cette étude, nous avons utilisé de vie et de mort de type sauvage C. elegans. Lorsque nous avons comparé la vitesse et la direction du mouvement actif de nématodes avec la descente passive de vers morts au sein du champ de la gravité, cette étude n'a montré aucune différence en descente fois. La descente moyenne est de 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s pour les deux les vers vivants et morts à l'aide de 633 nm cohérentelumière.

Le deuxième exemple est une étude de sélection individuelle C. de cas elegans changement de direction lors de la descente d'une colonne d'eau verticale. L'accélération et la force sont analysés dans cet exemple. Cette étude de cas démontre la portée des autres propriétés physiques qui peuvent être évaluées à l'aide SWSI tout en évaluant le comportement en utilisant des longueurs d'onde unique dans un environnement qui n'est pas accessible avec des microscopes traditionnels. Grâce à cette analyse, nous avons estimé un nématode individu est capable de pousser avec une force de plus de 28 nN.

Nos résultats indiquent que les nématodes vivant exercent 28 nN en tournant, ou se déplaçant contre le champ gravitationnel. Les résultats suggèrent en outre que les nématodes descendent passivement dans une colonne d'eau, mais peuvent activement résister à la force de gravité essentiellement en direction de rotation.

Introduction

Caenorhabditis elegans est un nématode du sol bénéfique libre-vivant qui est un organisme modèle puissant pour l'étude des mécanismes de régulation des gènes, le développement et, plus récemment, pour la compréhension de la biologie sensorielle et le comportement. Bien qu'ayant seulement 302 neurones, C. elegans sont capables de modèles complexes de locomotion, les comportements en matière de procréation, la navigation, la chimiotaxie et de nombreux autres comportements. C. elegans possèdent des mécanorécepteurs, chémorécepteurs et même détecter des longueurs d'onde de lumière bleue (Ward et al., 2008) ^1. Alors que l'on connaît bien les circuits neuronaux de la fonction sensori-motrice et les modèles de locomotion générales C. elegans, on connaît moins les réponses aux multiples stimuli simultanés ou des conditions environnementales plus complexes que ce qui peut être modélisé sous un microscope. Quelques études ont révélé des schémas de locomotion plus complexes qui sont ^2,3,4 très plastique. Notre approche méthodologique permettra études de nematodes en solution en temps réel où l'on peut facilement fournir des conditions environnementales multiples simultanément. Cette question est difficile à résoudre en utilisant des techniques d'imagerie conventionnelles basées sur le microscope. Nous avons développé une technique d'imagerie qui permet de placer les nématodes dans une colonne d'eau à examiner les comportements de locomotion, ainsi que de déterminer les capacités de nématodes à changer locomotion en réponse à différentes conditions environnementales.

Longueur d'onde unique Ombre Imaging (SWSI) est présenté dans le présent document pour la première fois à combler les lacunes de microscopes traditionnels. Microscopes classiques sont limités à observer des espèces dans un plan focal horizontal de quelques microns de profondeur ^5,6. En ce qui concerne les études de longueur d'onde unique, la plupart des microscopes traditionnels utilisent des filtres de couleurs pour filtrer la lumière blanche très large, généralement, 50-100 nm. L'utilisation d'un laser pour SWSI rétrécit la sélection de longueur d'onde à moins de 1 nm tout en conservant le signeintensité lumineuse ificant ^7. De même, les longueurs d'onde simples ont été utilisés pour mesurer les fréquences de natation de C. elegans en temps réel ^8.

Pour la première démonstration de notre méthode, nous surveillons la position horizontale, x, et la position verticale, y, d'un C. nager librement elegans dans une colonne d'eau, sur une distance d'environ un centimètre. En particulier, nous sommes intéressés par le mouvement vertical puisque la gravité agit également verticalement. La pente d'un ajustement linéaire à la position verticale donne la vitesse verticale, v _y, du nématode à mesure qu'il descend dans la colonne d'eau:
(1)

La moyenne quadratique de l'erreur (RMSE) ⁹ indique la qualité de l'ajustement et indique si la vitesse de descente est généralement constante. Les vitesses verticales sont alors en moyenne pour eacespèces h et vers morts. Grâce à ces résultats, la traînée, qui l'expérience de vers peut être estimée.

Pour la deuxième manifestation de notre méthode, nous avons sélectionné C. elegans qui ne descendent à une vitesse constante contrairement à la majorité des vers observées. Les vers choisis soit tourné autour et a nagé vers le haut ou plané pendant un moment avant de continuer la descente. Physiquement, cette étude de cas montre que la poussée d'un micro-organisme de natation peut être calculé. Les lois de Newton exigent qu'un corps qui change de direction accélère, ce qui implique une force nette, , Agit sur ce corps ^10:
(2)

où estla quantité de mouvement et t est le temps. L'accélération de la vis sans fin est directement proportionnelle à la force agissant sur la vis sans fin car la masse de la vis reste constante. En conséquence, la force nette est verticale:
(3)

où m est la masse d'une vis sans fin et d'un _y représente l'accélération verticale. La force nette dans la direction verticale représente alors la poussée de ver dans la même direction. La poussée totale peut être calculé en prenant la composante horizontale en compte.

Protocol

Une. C. elegans Préparation Préparer des boîtes de Pétri de jeune adulte C. elegans comme décrit dans les expériences précédentes, notamment la suspension de C. elegans dans une cuvette remplie de fluide 11. Le jour de l'analyse vidéo, sélection de jeunes vivants nématodes adultes directement dans une cuve remplie avec de l'eau distillée désionisée en utilisant une pointe de platine tel que décrit dans l'étape 2. Préparer mort C. elegans à l'exposition de chloroforme. Continuer en suivant le mode opératoire décrit pour la cueillette des nematodes vivants décrites à l'étape 2. 2. Configuration optique pour l'analyse de la vidéo Assembler le montage expérimental pour créer des images d'ombre comme le montre la Figure 1. L'appareil peut être placé à une distance quelconque de l'écran dans la mesure où il est capable de capturer une vue frontale de l'écran. Un bon endroit est à côté de la cuvette face à l'écran. Utilisation d'au moins deux miroirs àdiriger la sortie du laser Hélium-Néon accordable dans un expanseur de faisceau galiléen afin que le faisceau est dilaté à un diamètre de 12 mm. Placer un ou deux trous d'épingle dans le trajet du faisceau de telle sorte que le faisceau passe à travers les trous d'épingle sans être gênés. Utilisez les piqûres d'assurer l'alignement est maintenu. Diriger le faisceau étendu sur une cuvette de quartz qui est monté 10 mm de large, 10 mm de profondeur et 4 cm de hauteur. Amplifier le faisceau en utilisant une lentille plan-convexe ayant une longueur focale positive de 75 mm. Placez un écran de projection d'environ 120 cm de l'objectif. Des distances supérieures à ce donneront un plus fort grossissement de l'image de l'ombre. Cependant, la qualité de l'image diminue avec une intensité lumineuse plus faible et une noticeability accru de brouillage de diffraction. Placer une caméra à haute vitesse, qui est capable d'au moins 60 images par seconde, juste à côté de la cuvette face à l'écran. Placez un microscope à dissection près de l'ensemble optiquepour un transfert rapide des nématodes dans la cuvette. Fixez temporairement une règle transparente avec les divisions mm au centre du support de cuvette perpendiculaire au faisceau élargi de sorte que les projets de faisceau une image agrandie de la règle sur l'écran. Réglez l'échelle de longueur pour l'analyse vidéo. Sur l'écran de projection, marquer la distance à grande échelle en utilisant une règle transparente hors centre de l'image projetée pour éviter de gêner la projection. Cliquez ici pour la vidéo. Notez cette image et de mesurer le grossissement. Supprimer la règle de la configuration. Répétez cette étape pour les autres longueurs d'onde que l'angle de réfraction de la lumière pour chaque longueur d'onde à travers la lentille varie due à des aberrations chromatiques. Remplacer la cuvette et le remplir à moins de 1 mm de la jante avec de l'eau distillée. Commencez l'enregistrement tandis que la lumière ambiante est de sorte que la distance de l'échelle est comprise dans le mêmeimages que l'image projetée. Coupez le feu. L'utilisation d'un mince, aplati pick fils de platine, déplacer jeune adulte individuelle C. elegans un à la fois à partir de la plaque de gélose dans la cuvette en touchant la reprise à la surface de l'eau. Le nématode sera visible dans la colonne d'eau quand il entre dans le faisceau à cause de la lumière diffusée. Cliquez ici pour la vidéo. Filmer les images projetées des vers de leur passage dans le faisceau laser étendu. Il est important de noter que l'image projetée est inversé et les vers semblera se déplacer dans le sens opposé de leur mouvement réel. Worms qui descendaient avec la gravité apparaîtront à déplacer vers le haut sur l'écran (Figure 2). 3. Préparation des données vidéo Importer la vidéo dans le programme d'analyse vidéo. Réglez l'échelle en utilisant le facteur de grossissement déterminé précédemment. Track le déplacement linéaire de la tête du nématode ombragé avec au moins 10 points de données sur l'ensemble du chemin parcouru. Trouver la vitesse dans la direction verticale en prenant dérivé ("Y", "Time") et diviser cette valeur par le facteur de grossissement déterminé à l'étape 2.2. 4. Analyse des données Analyser la descente linéaire d'un C. elegans: Assurez-vous que les points de données sur la position verticale par rapport graphique en temps forment généralement une ligne droite. Certains écarts peuvent être ignorés en raison du mouvement de la tête du nématode. Si les points de données forment généralement une ligne droite, passez à l'étape 4.1.2, sinon la descente est non linéaire et l'analyse doit être poursuivie en utilisant l'étape 5.1 dans ce protocole. Créer une ligne de régression linéaire par une régression linéaire 12 aux données dans le menu Analyse. La pente de cette ligne est alors la vitesse verticale de la C.elegans. La pente est la variation de position divisée par la variation dans le temps sur un intervalle particulier. Déterminer la vitesse de descente des vers vivants et morts de cette manière (Figure 3). La moyenne des vitesses verticales de natation des nématodes. Une taille d'environ 50 vers l'échantillon est suffisante. Comparer les vitesses de natation dans des vers vivants avec des vitesses de dérive dans les vers morts. 5. Analyse non linéaire motion de C. elegans De la section 3, sélectionnez un fichier vidéo analysé, qui montre une descente non linéaire dans la colonne d'eau (figure 4). Une descente non linéaire peut être identifié en utilisant l'étape 4.1.1 dans ce protocole. Sélectionnez «Ajustement de courbe» dans le menu «Analyse» dans le logiciel d'analyse vidéo. Sélectionner un second ordre (quadratique) polynôme. Monter la courbe. Pour une région d'intérêt, l'ajuster sur le graphique en faisant glisser les crochets de chaque côté of l'ajustement sur la courbe jusqu'à ce que la courbe est très proche des points de données à l'intérieur de la forme et / ou bien à l'intérieur des barres d'erreur. Le programme d'ajustement donne une expression mathématique pour la courbe ajustée, qui est la position verticale par rapport au temps. Considérer les erreurs de courbe ajustée proposés par le programme associé aux propriétés physiques. Une erreur relative de 15% ou moins est généralement acceptable. Ajouter plus courbe suffira à d'autres sections de données. Spline 13 fonctions pour une couverture optimale: assurez-vous que l'ajustement de la courbe de chevauchement et d'essayer d'aligner les courbes adjacentes de sorte que le match des pistes dans les zones de chevauchement. Obtenir la vitesse pour une région d'intérêt en prenant la dérivée de la courbe ajustée en utilisant l'expression mathématique obtenue dans l'étape 5.1.3. Vitesses peuvent varier dans le temps. Notez que le dérivé est la pente d'une fonction. Le dérivé peut être obtenue mathématiquement ou graphiquement. Dans ce cas, il est pratique d'utiliser la expr mathématique donnéeession. Prendre la dérivée seconde des courbes ajustées pour obtenir l'accélération. L'accélération peut varier dans le temps. Multiplier l'accélération par la masse de ver pour calculer la poussée, qui exerce le ver. Une masse estimée raisonnable est de 3 pg en supposant que le ver se compose principalement d'eau.

Representative Results

Descente régulière La première enquête montre pas de différence distingue dans les taux de la C. descendantes elegans pendant SWSI utilisant 633 nm. Les taux décroissants sont révélés être constant à 1,5 mm / sec ± 0,1 mm / sec à la fois pour le temps réel et la mort C. elegans. Une taille de 50 vers l'échantillon généré un écart raisonnable de 7% à la fois pour la vie et les vers morts. Il n'y a pas d'accélération agissant sur les vers, depuis la vitesse de descente est constant, de sorte que la force de résistance est égale à la force de gravitation diminuée de la force de flottabilité. Cela suppose que la densité de la vis sans fin est légèrement plus grande que celle de l'eau; Toutefois, pour les estimations ci-dessous, il est toujours pratique de supposer que la densité d'un nématode est à peu près celle de l'eau. Changement d'orientation La deuxième enquête, une étude de cas démontre que les nématodes sont capables de changer de direction et peuvent nager vers le haut contregravité. Deux courbes ont été ajustées au déplacement vertical du nématode de sorte que les dérivées secondes de ces courbes peuvent être cannelés pour afficher l'accélération en fonction du temps (figure 5). Il est conseillé de garder l'ordre polynôme aussi bas que possible tout en maintenant un bon ajustement. Un polynôme de degré inférieur indique moins de variation dans l'accélération au cours du temps. Les termes polynomiaux d'ordre supérieur seront négligeables, et donc inutile, si l'ordre du polynôme est trop élevé. Ce ver décélère à un taux constant de 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2, se retourne et accélère à la même vitesse de 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2 jusqu'à peu de temps après le point de retournement. Le C. elegans continue à se déplacer vers le haut avec une diminution de l'accélération de 1,252 à 0,00708 t en mm / sec jusqu'à ce que l'accélération 2 tombe à zéro. Gardant à l'esprit l'équation. 3, et une masse de ver d'environ 3 & #956; g, le ver subit une force verticale nette, F Ny, de 0,33 pN jusqu'à peu de temps après le point de retournement. Descente: Il existe trois types de forces agissant sur la vis sans fin jusqu'à ce que le ver a atteint le point de retournement: la gravité, la traînée, la flottabilité et de poussée (figure 6a). La force nette est égale à la somme vectorielle de l'ensemble des trois forces. Ici, nous considérons les composantes verticales uniquement: F Ny = F + F Dy Ty-F g + F B (4) où F B est la force de flottabilité. F g est égale en grandeur mais opposée en direction à la force de poussée en supposant que la densité de la vis est celui de l'eau. Eq. 4 peut alors s'écrire de la manière suivante: F Ny = F + F Dy Ty (5) F Ny reste constante pendant la descente. Ceci implique queF Dy + F Ty reste constante jusqu'à ce que le nématode atteint le point de retournement. F Dy est la plus grande au sommet, qui est le début du chemin, et réduit progressivement à zéro jusqu'à ce que la vitesse est nulle au point d'exécution tandis que F Ty doit augmenter pour maintenir F Ny constante. Redressement: Il n'ya pas de force de traînée dans la direction verticale au point d'exécution puisque la vitesse verticale est égale à zéro à ce moment-là. Les seules forces agissant dans le sens vertical sont la gravité, – F g, la flottabilité, F B et la poussée verticale ver, F Ty, comme le montre la figure 6b. À ce stade, la poussée de la C. elegans peuvent être déterminés: F Ty = F Ny (6) La poussée sur le fond de la trajectoire est alors à peu près égal à 0,33 pN, ce qui représente environ 0,001% du poids de la vis sans fin. Tenantcompte que le poids estimé, F g d'un C. elegans est de 28 nN, Montée: De même, lors de l'ascension, la traînée augmente mais est pointé vers le bas (figure 6c): F = Ny-F Dy + F Ty (7) La poussée mis en œuvre par le ver doit maintenant être encore plus grand et égal à la somme de la force de traînée et le poids. Le ver se ralentit après avoir commencé à nager vers le haut. Pour nager à la même vitesse que le ver est descendu, le ver aurait à exercer une poussée vers le haut d'au moins deux fois son poids. Survol Un exemple d'une vis sans fin qui ralentit sa descente pendant environ 3 sec est présentée dans la figure 7. Un polynôme 3 ème degré est un ajustement raisonnable pour le chemin ensemble. Les erreurs dans l'accélération et la vitesse de cette forme sont à moins de 15%. Le ver commence par une importante upwae poussée, ralentit et commence à tourner autour de 68 sec; Cependant, l'accélération diminue de façon continue vers le haut (Figure 8) jusqu'à ce que l'accélération nette égale à zéro autour de 68,5 sec. Ceci conduit finalement à une accélération nette dans la direction vers le bas suivi d'un autre point de la vitesse nulle (figure 9) et le nématode commence à redescendre à 69 sec. Il est intéressant de noter que l'accélération verticale maximale observée dans ce cas est de 2,7 mm / s 2. L'accélération dans les points de retournement sont 0,455 mm / s 2 et – 0,455 mm / s respectivement 2; environ quatre fois plus grande que dans le cas du nématode qui se retourne et nage vers le haut. En utilisant l'équation. 6, on peut estimer que la poussée vers le haut est d'environ 1,32 pN au premier tournant. Lors de la deuxième tournant, l'accélération net est négatif de sorte que la poussée vers le haut est 1.32 pN. Figure 1. D'installation expérimentale. L'laser, élargisseur de faisceau, objectif et l'écran sont essentiels pour le montage expérimental. Les miroirs de direction et de piqûres peuvent être omis, mais feront l'alignement optique moins stable. Figure 2. Longueur d'onde unique Ombre image (SWSI). Utilisation de 2 mW de 543 nm lumière laser l'ombre d'un ver est projetée sur un écran. L'image est inversée de sorte que le nématode semble tomber vers le haut. 424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/> Figure 3. Vertical descente d'un seul type sauvage C. elegans dans une colonne d'eau. Ce nématode a été assombrie par 633 nm lumière cohérente. La pente de la régression linéaire indique une vitesse de descente de 1,09 mm / s ± 0,01 mm / sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. Graphique Déplacement d'une seule hausse piscine de type sauvage C. elegans. Deux crises cannelés tracent le chemin global du nématode. La dérivée seconde de la forme révèle l'accélération. L'accélération maximale est facilement déterminée à partir de la première forme: 0.110 mm / Sec 2 ± 0,002 mm / s 2. Seuls quelques barres d'erreur sont présentés de sorte que les points de données et l'ajustement restent visibles. Ce nématode a été assombrie par 633 nm lumière cohérente. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. Accélération graphique d'un seul type sauvage C. elegans. Ce nématode maintient une accélération à la hausse constante de 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2 amenant à ralentir puis déplacer vers le haut. Peu de temps après le point de retournement de l'accélération diminue de façon constante et l'accélération net diminue à zéro. g "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Diagrammes Figure 6. Force pour la descente, le point et la montée. La flottabilité et la gravité de tournage sont de grandeur égale et de direction opposée de sorte que l'effet de ces forces s'annulent. Ils ne sont donc pas présentés dans ces schémas. (A) Le ver est décroissant avec la drague et la poussée vers le haut. (B) Le ver est au point bas de la trajectoire sans glisser. La poussée est orientée vers le haut. (C) Le ver est croissant avec glisser vers le bas tandis que la poussée est orientée vers le haut. "Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/> Figure 7. Graphique Déplacement de seul nématode planant. Le ver ralentit et commence à tourner autour à environ 68 secondes, mais commence à descendre environ 69 sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. .. Figure 8 Accélération graphique d'un seul nématode planant Ce ver commence avec une accélération à la hausse de 2,7 mm / s 2, diminue à zéro et, finalement, a une accélération vers le bas de -. 2,6 mm / s 2 S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand Version de ce chiffre. Figure 9. Velocity graphique d'un seul nématode planant. Ce ver s'arrête à 68 secondes et commence à se diriger vers le haut, ralentit et atteint une vitesse nulle dans la direction verticale à 69 sec suivie d'une descente. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de cette figure. Tableau 1. Vitesses de descente moyen de N2 C. elegans. 50 en direct et 50 nématodes morts sont tracked pendant leur descente. La vitesse moyenne pour les descentes en est de même pour le live et les vers morts: 1,5 mm / s ± 0,1 mm / sec.

Discussion

La technique SWSI fournit un moyen supplémentaire pour comprendre les capacités locomotrices des organismes microscopiques comme les nématodes vivant en liberté. Avec cette technique, nous avons distingué locomotion active (natation) et dérive passive due à la gravité d'exploitation sur les nématodes morts. En outre, lorsque les nématodes nageurs changent de direction lors de la locomotion dans l'eau, nous sommes capables de mesurer les forces de traînée et les forces angulaires, qui opèrent sur les nématodes et exercées par les nématodes.

Nématodes rencontrent des conditions environnementales différentes dans le sol. Il existe de poches d'eau dans le sol, ainsi que des particules solides et des matériaux biologiques de différentes formes et de textures. En outre, les nématodes existent dans un environnement gravitationnel qu'ils répondent à ^14. En outre, les nématodes à proximité de la surface du sol sont exposées à différentes longueurs d'onde de lumière, les changements de température et d'humidité, ainsi que biologiquedes variables comme les bactéries, les champignons prédateurs et d'autres organismes du sol. Les nématodes doivent répondre à toutes ces différentes variables, nager et de ramper dans différents médias, en tournant et en modifiant les stratégies de navigation. Tous ces calculs complexes sont réalisés par seulement 302 neurones, un sous-ensemble qui sont impliqués dans la locomotion, et 95 cellules mur musculaires du corps. Les mesures de la sorte décrite par technique SWSI fournissent des informations importantes sur la façon dont les nématodes accomplir cette complexité navigation.

Pour la première partie, nous avons mesuré le taux de descente globale de type sauvage C. elegans à 633 nm lumière. Grâce à ces mesures, nous pouvons estimer la force de traînée un ver rencontres.

Pour l'étude d'un nématode accélération de cas, les forces impliquées changement continue depuis la force de traînée changements avec la vitesse. Il ya certaines déclarations que nous sommes capables de faire sur les forces agissant sur la vis sans fin. Comme le ver ralentit et tente de swim vers le haut la composante verticale de la force de traînée diminue jusqu'à ce qu'elle atteigne zéro au point bas de la trajectoire du nématode. À ce stade, le ver doit avoir une force vers le haut pour remonter.

Cette méthode peut être modifiée de plusieurs manières. Toutes les espèces microscopiques qui navigue dans un liquide clair peuvent être suivis en utilisant SWSI. Les études peuvent être réalisées avec des longueurs d'onde qui sont accessibles aux appareils photo numériques. Les appareils photo numériques seront généralement ramasser des longueurs d'onde allant de l'UV à l'IR proche. En outre, des études peuvent être conduites horizontales en dirigeant le laser verticalement vers le haut. Les espèces peuvent ensuite être placés sur une surface transparente horizontale, comme une lame de microscope. Réglage de l'élargisseur de faisceau ou la loupe après l'élargisseur de faisceau peut aiguiser les images floues. L'utilisateur doit être sûr de fixer tous les composants de la table pour assurer l'alignement du faisceau cohérent et facile.

Le procédé est limité par la disposition wavelengt laserhs et résolution. En substance, les avantages de cette méthode sur des microscopes existants, qui sont la flexibilité dans des directions et des longueurs d'onde, sont aussi des faiblesses car l'installation est simple. L'optique non avertis et taches de laser limitent la résolution. Certains de ces inconvénients peuvent certainement être améliorés à l'avenir, y compris par filtre spatial et projeter l'image directement sur une caméra CCD.

Les étapes les plus critiques dans le protocole peuvent être facilement appris que l'expérience est effectuée pour la première fois. Placer le nématode dans la cuvette sans créer de turbulence est critique. En outre, les vibrations peuvent perturber la configuration et de modifier le comportement des vers. Veillez à limiter le pouvoir, qui est utilisé à l'ombre d'image. 2 mW pour un faisceau laser qui est de 1 mm de diamètre doit être au maximum pour éviter des effets de chauffage. L'installation doit être testé pour la diffusion des effets lors de l'utilisation de liquides autres que l'eau distillée.

Actuellement, la plupart microscopes fonctionnent sur un plan horizontal à l'aide de lumière ou de filtres de couleur blanche, qui sont encore très large dans la gamme de longueur d'onde. Microscopes qui utilisent vraiment longueurs d'onde simples et avoir une flexibilité dans le scénario de visualisation, c'est à dire le positionnement horizontal, sont généralement limités à un avantage ou l'autre. En outre, ces types de microscopes sont généralement très coûteux et toujours limité à la différence des plans focaux notre méthode. Notre installation peut facilement être construit avec un budget extrêmement faible. Cette méthode est prêt à être utilisé par les écoles, les entreprises environnementales ainsi que d'autres entités qui fonctionnent avec peu de financement. Dans l'avenir, cette méthode peut être utilisée dans une configuration très sophistiqué pour étudier les effets en temps réel sur la locomotion et mécanosensibilité d'espèces microscopiques. Ce procédé permet des études de longueur d'onde unique à une large gamme d'angles et profondeurs de visualisation facilement disponibles.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants pour le soutien de l'Institut Vassar College recherche de premier cycle d'été (URSI), le Fonds de recherche sur le saumon Lucy Maynard, prix de la NASA n ° NX09AU90A, Centre National Science Foundation pour l'excellence de la recherche en science et technologie (NSF-CREST), sentence n ° 0630388 et la NSF, sentence n ° 1058385.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm	Thorlabs	LA1257

References

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Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

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