Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Alicia Jago; Tewa Kpulun; Kathleen M. Raley-Susman; Jenny Magnes

doi:10.3791/51424

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Engineering

واحد الطول الموجي الظل التصوير من انواع معينة ايليجانس تقديرات تنقل القوة بما في ذلك

Published: April 18, 2014

doi:

10.3791/51424

Alicia Jago¹, Tewa Kpulun¹, Kathleen M. Raley-Susman², Jenny Magnes¹

¹Physics and Astronomy Department,Vassar College, ²Biology Department,Vassar College

Summary

تقنية المعروضة هنا يقيس مسار السباحة بحرية الأنواع المجهرية باستخدام التعرض الطول الموجي واحد. C. وتستخدم لإثبات ايليجانس التصوير الظل كبديل غير مكلفة لالمجاهر مكلفة. هذه التقنية يمكن تكييفها لاستيعاب مختلف التوجهات، والبيئات والأنواع لقياس الاتجاه والسرعة والتسارع والقوات.

Abstract

وتوضح هذه الدراسة تقنية غير مكلفة وبسيطة التي تسمح للقياس الخصائص الفيزيائية مثل الموقع والسرعة والتسارع والقوات المشاركة في السلوك الحركي من الديدان الخيطية معلقة في عمود من الماء ردا على موجات واحدة من الضوء. ونحن لشرح كيفية تقييم تحرك لكائن المجهري باستخدام الطول الموجي واحدة الظل التصوير (SWSI) باستخدام اثنين من أمثلة مختلفة.

المثال الأول هو دراسة منهجية وقابلة للحياة إحصائية من متوسط نزول C. ايليجانس في عمود من الماء. لهذه الدراسة، كنا الأحياء منهم والأموات wildtype C. ايليجانس. عندما قارنا سرعة واتجاه حركة نشطة الخيطية مع النسب السلبية من الديدان الميتة ضمن مجال الجاذبية، وأظهرت هذه الدراسة أي اختلاف في النسب مرات. كان متوسط النسب 1.5 ملم / ثانية ± 0.1 ملم / ثانية لكل من الديدان الحية والميتة باستخدام 633 نانومتر متماسكةضوء.

المثال الثاني هو دراسة حالة فردية حدد C. ايليجانس تغيير الاتجاه خلال النسب في عمود الماء العمودي. ويتم تحليل التسارع والقوة في هذا المثال. يوضح دراسة الحالة هذه على نطاق الخصائص الفيزيائية الأخرى التي يمكن تقييمها باستخدام SWSI حين تقييم السلوك باستخدام موجات واحد في بيئة لا يمكن الوصول إليه مع المجاهر التقليدية. باستخدام هذا التحليل قدرنا على الديدان الخيطية الفرد قادر على الجة مع قوة تزيد على 28 ن ن.

النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الديدان التي تعيش بذل ن ن 28 عندما تحول، أو تتحرك ضد مجال الجاذبية. المزيد من النتائج تشير إلى أن الديدان الخيطية تنحدر بشكل سلبي في عمود من الماء، ولكن يمكن أن تقاوم بنشاط قوة الجاذبية في المقام الأول عن طريق تحويل الاتجاه.

Introduction

انواع معينة ايليجانس هو الخيطية التربة المفيدة التي تعيش بحرية وهذا هو كائن نموذج قوية لدراسة آليات تنظيم الجينات، والتنمية، ومؤخرا لفهم البيولوجيا الحسية والسلوك. على الرغم من وجود 302 فقط الخلايا العصبية، C. ايليجانس قادرون على الأنماط المعقدة الحركي والسلوكيات الإنجابية، والملاحة، والكيميائي العديد من السلوكيات الأخرى. C. ايليجانس تمتلك mechanoreceptors، المستقبلات الكيميائية وحتى كشف الأطوال الموجية من الضوء الأزرق (وارد وآخرون، 2008) ^1. في حين أن الكثير يعرف عن الدوائر العصبية الحسية وظيفة وأنماط الحركي العام في C. ايليجانس، لا يعرف الكثير عن الردود على عدة محفزات المتزامنة أو أكثر تعقيدا من الظروف البيئية يمكن أن تكون على غرار تحت المجهر. وقد كشفت بعض الدراسات أنماط الحركي أكثر تعقيدا التي هي ^2،3،4 البلاستيك للغاية. سيكون لدينا منهجية تمكين دراسات نواعمatodes في الحل في الوقت الحقيقي حيث أننا يمكن أن توفر بسهولة الظروف البيئية متعددة في نفس الوقت. هذا السؤال من الصعب معالجة باستخدام تقنيات التصوير التقليدية القائمة على المجهر. قمنا بتطوير تقنية التصوير التي تسمح لنا لوضع الديدان الخيطية ضمن عمود الماء لدراسة السلوكيات الحركي، فضلا عن تحديد قدرات الديدان الخيطية لتغيير تحرك استجابة لظروف بيئية مختلفة.

ويرد واحد الطول الموجي الظل التصوير (SWSI) في هذه الورقة لأول مرة لمعالجة أوجه القصور في المجاهر التقليدية. المجاهر التقليدية تقتصر على مراقبة الأنواع في طائرة التنسيق الأفقي بضعة ميكرونات في عمق ^5،6. بخصوص الدراسات الطول الموجي واحد، ومعظم المجاهر التقليدية استخدام مرشحات لونية لتصفية الضوء الأبيض على نطاق واسع جدا، وعادة، 50-100 نانومتر. باستخدام الليزر لSWSI يضيق اختيار الطول الموجي إلى أقل من 1 نانومتر مع الحفاظ على علامةشدة الضوء ificant ^7. وبالمثل، استخدمت موجات واحدة لقياس الترددات السباحة C. ايليجانس في الوقت الحقيقي ^8.

لأول مظاهرة من أسلوبنا، نحن نراقب الوضع الأفقي، والعاشر، والوضع الرأسي، ص، من السباحة بحرية C. ايليجانس في عمود الماء، على مسافة حوالي سنتيمتر واحد. على وجه الخصوص، ونحن مهتمون في الحركة العمودية منذ الجاذبية يعمل أيضا عموديا. المنحدر من نوبة خطية إلى الوضع الرأسي يعطي السرعة الرأسية، والخامس _ص، من الديدان الخيطية لأنه ينزل في عمود الماء:
(1)

جذر متوسط مربع الخطأ (RMSE) ⁹ يشير إلى نوعية تناسب ويشير إلى ما إذا كانت السرعة الهابطة هو ثابت عموما. ثم يتم حساب متوسط سرعات الرأسي للمجموعة شرق افريقياالأنواع ساعة والديدان الميتة. باستخدام هذه النتائج، والسحب، والتي يمكن أن تقدر تجربة الديدان.

للمظاهرة الثانية من أسلوبنا، اخترنا C. ايليجانس التي لم تنزل بمعدل ثابت على عكس غالبية الديدان ملاحظتها. الديدان اختيارها إما استدار وسبح صعودا أو حلقت لفترة من الوقت قبل مواصلة النسب. جسديا، وتبين دراسة الحالة هذه أن فحوى الكائنات الحية الدقيقة السباحة يمكن حسابها. قوانين نيوتن تملي أن الجسم الذي يغير الاتجاهات يسرع، مما يعني قوة الشبكة، ، هو بناء على تلك الهيئة ^(10):
(2)

حيث هوالزخم الخطي ور هو الوقت. تسارع دودة يتناسب طرديا مع القوة المؤثرة على دودة منذ كتلة دودة لا تزال مستمرة. ونتيجة لذلك، فإن القوة الصافية العمودي هو:
(3)

حيث m هي كتلة من دودة _وذ يمثل التسارع العمودي. القوة الصافية في الاتجاه الرأسي يمثل دودة ثم التوجه في نفس الاتجاه. ويمكن حساب التوجه الكلي من خلال اتخاذ المكون الأفقي في الاعتبار.

Protocol

1. C. إعداد ايليجانس إعداد لوحات بتري من الشباب البالغين C. ايليجانس كما هو موضح في التجارب السابقة التي تنطوي على تعليق C. ايليجانس في السوائل تملأ كفيت 11. في يوم من تحليل الفيديو، واختيار العيش الديدان الخيطية الكبار الصغار مباشرة إلى كفيت مملوءة بالماء منزوع الأيونات، المقطر باستخدام معول البلاتين كما هو موضح في الخطوة 2. إعداد القتلى C. ايليجانس مع التعرض الكلوروفورم. تستمر باتباع الإجراء الموضح لاختيار الديدان الخيطية الحية هو موضح في الخطوة 2. 2. إعداد البصرية لتحليل الفيديو تجميع الإعداد التجريبية لخلق صور الظل كما هو مبين في الشكل 1. يمكن وضع الكاميرا في أي المسافة من الشاشة طالما أنها قادرة على التقاط وجهة نظر الأمامية للشاشة. مكان جيد بجانب كفيت التي تواجه الشاشة. باستخدام اثنين على الأقل المرايا لتوجيه الانضباطي انتاج الليزر الهليوم النيون في المتوسع شعاع الجليل بحيث يتم توسيع شعاع ليبلغ قطرها 12 ملم. مكان واحد أو اثنين من الثقوب في مسار الشعاع بحيث يمر شعاع من خلال الثقوب دون عرقلة. استخدام الثقوب لضمان الحفاظ على المحاذاة. توجيه شعاع توسعت على كوفيت الكوارتز شنت الذي هو 10 ملم واسعة، 10 ملم العميق و 4 سم. تضخيم شعاع باستخدام عدسة محدبة، بلانو مع طول بؤري 75 مم الإيجابية. وضع شاشة العرض حوالي 120 سم من العدسة. سوف مسافات أكبر من هذا تسفر عن التكبير أكبر من صورة الظل. ومع ذلك، فإن جودة الصورة تنخفض مع انخفاض شدة الضوء وnoticeability زيادة التدخل الحيود. وضع كاميرا عالية السرعة، والتي هي قادرة على لا يقل عن 60 إطارا في الثانية، بجوار كفيت التي تواجه الشاشة. وضع مجهر تشريح بالقرب من مجموعة البصريةحتى لنقل السريع من الديدان الخيطية في كفيت. تأمين مؤقتا مسطرة شفافة مع الشعب ملم إلى وسط حامل كفيت عمودي على شعاع توسعت بحيث المشاريع شعاع صورة مكبرة للحاكم على الشاشة. تعيين مقياس طول لتحليل الفيديو. على شاشة العرض، بمناسبة حجم المسافة باستخدام مسطرة شفافة قبالة مركز من الصورة المسقطة لتجنب التداخل مع الإسقاط. اضغط هنا للفيديو. تسجيل هذه الصورة وقياس التكبير. إزالة الحاكم من الإعداد. كرر هذه الخطوة لموجات أخرى مثل زاوية انكسار الضوء لكل طول موجي من خلال عدسة سوف تختلف بسبب الانحرافات اللونية. استبدال كفيت وملئه إلى حدود 1 ملم من الحافة مع الماء المقطر. بدء التسجيل في حين أن ضوء الغرفة على بحيث يتم تضمين حجم المسافة في نفسلقطات كصورة المتوقعة. تحويل ضوء قبالة. باستخدام رقيقة، بالارض اختيار سلك البلاتين، نقل الشباب البالغين الفردية C. ايليجانس في وقت واحد من لوحة أجار في كفيت عن طريق لمس معول على سطح الماء. سوف الخيطية تصبح مرئية في عمود الماء عندما يدخل شعاع بسبب الضوء المتناثرة. اضغط هنا للفيديو. تصوير الصور المتوقعة من الديدان لأنها تمر من خلال شعاع الليزر الموسعة. من المهم أن نلاحظ أن هو مقلوب الصورة المسقطة وسوف تظهر الديدان على التحرك في الاتجاه المعاكس لحركتها الفعلية. والديدان التي تنازلي مع الجاذبية يبدو أن التحرك التصاعدي على الشاشة (الشكل 2). 3. إعداد بيانات الفيديو استيراد الفيديو إلى برنامج تحليل الفيديو. تعيين المقياس باستخدام معامل التكبير التي سبق تحديدها. هيئة تنظيم الاتصالاتالمسيخ تشريد خطية من رئيس الديدان الخيطية مظلل مع 10 نقطة على الأقل البيانات عبر المسار بالكامل اتخاذها. العثور على السرعة في الاتجاه الرأسي من خلال اتخاذ المشتقة ("Y"، "تايم") وتقسم هذه القيمة من قبل عامل التكبير تحديدها في الخطوة 2.2. 4. تحليل البيانات تحليل النسب خطية من C. ايليجانس: تحقق للتأكد من أن نقاط البيانات على وضع عمودي مقابل الرسم البياني الوقت تشكل عموما خط مستقيم. يمكن تجاهل بعض الانحرافات بسبب حركة الرأس من الديدان الخيطية. إذا كانت نقاط البيانات عموما تشكل خط مستقيم، انتقل إلى الخطوة 4.1.2، وإلا فإن النسب هو غير الخطية وينبغي مواصلة التحليل باستخدام الخطوة 5.1 في هذا البروتوكول. إنشاء خط الانحدار الخطي من المناسب خط مستقيم 12 إلى البيانات من القائمة التحليل. المنحدر من هذا الخط هو ثم سرعة العمودي للC.ايليجانس. المنحدر هو التغيير في الموقف مقسوما على التغيير في الوقت المناسب خلال فترة زمنية معينة. تحديد سرعة نزول الديدان الحية والميتة في هذه الطريقة (الشكل 3). متوسط سرعات السباحة الرأسية من الديدان الخيطية. وحجم عينة من نحو 50 الديدان كافية. مقارنة السرعات السباحة في الديدان الحية مع السرعات الانجراف في الديدان الميتة. 5. تحليل الحركة غير الخطية من C. ايليجانس من القسم 3، حدد ملف الفيديو تحليلها، مما يدل على أصل غير الخطية داخل عمود الماء (الشكل 4). ويمكن التعرف على أصل غير الخطية باستخدام الخطوة 4.1.1 في هذا البروتوكول. اختر 'المنحنى صالح' من القائمة 'تحليل' في برنامج تحليل الفيديو. تحديد الدرجة الثانية (الدرجة الثانية) كثيرات الحدود. تناسب المنحنى. للمنطقة من الفائدة، وضبط احتواءه على الرسم البياني عن طريق تحريك الأقواس على كل جانب سو تناسب على الرسم البياني حتى المنحنى هو قريب جدا من نقاط البيانات داخل مناسبا و / أو جيدا داخل أشرطة الخطأ. البرنامج المناسب يعطي تعبير رياضي لمنحنى المجهزة، وهو وضع عمودي مقابل الوقت. النظر في الأخطاء منحنى المجهزة التي قدمها البرنامج المقترن الخصائص الفيزيائية. خطأ النسبية 15٪ أو أقل وعادة ما يكون مقبولا. إضافة المزيد من منحنى يناسب لتغطية أقسام إضافية من البيانات. خدد 13 وظائف للتغطية الأمثل: تأكد من أن منحنى يناسب التداخل ومحاولة محاذاة المنحنيات المجاورة بحيث المباراة المنحدرات في المناطق المتداخلة. الحصول على سرعة لمنطقة من الاهتمام من خلال اتخاذ مشتق من منحنى المجهزة باستخدام تعبير رياضي حصلت عليه في الخطوة 5.1.3. قد تختلف السرعات في الوقت المناسب. لاحظ أنه مشتق هو المنحدر من وظيفة. يمكن الحصول على المشتقة رياضيا أو بيانيا. في هذه الحالة هو عملية لاستخدام EXPR الرياضية نظراession. اتخاذ المشتق الثاني من منحنيات المجهزة للحصول على التسارع. قد تختلف تسارع في الوقت المناسب. مضاعفة تسارع من قبل دودة الشامل لحساب الاتجاه الذي يمارس الدودة. كتلة المقدرة معقولة هو 3 ميكروغرام على افتراض أن دودة يتكون في معظمه من الماء.

Representative Results

أصل ثابت أظهر التحقيق الأولى لا فرق مميزة في معدلات الهابطة من C. ايليجانس خلال SWSI باستخدام 633 نانومتر. تم العثور على معدلات الهابطة لتكون ثابتة عند 1.5 مم / ثانية ± 0.1 ملم / ثانية لكل من يعيش والأموات C. ايليجانس. وحجم عينة من 50 الديدان ولدت الفرق معقول من 7٪ لكلا المعيشة والديدان الميتة. ليس هناك تسارع بناء على الديدان منذ سرعة تنازلي مستمر، حتى أن قوة السحب تساوي قوة الجاذبية ناقص قوة الطفو. هذا يعني أن كثافة دودة أكبر بقليل من الماء؛ ومع ذلك، من أجل تقديرات أقل من ذلك لا تزال عملية لنفترض أن كثافة من الديدان الخيطية هو ما يقرب من ذلك من المياه. تغيير اتجاه التحقيق الثاني، دراسة حالة، يدل على أن الديدان قادرة على تغيير الاتجاه ويمكن أن تسبح صعودا ضدالجاذبية. تم تركيب اثنين من منحنيات إلى تشريد العمودي للالخيطية بحيث يمكن محزوزة المشتقات الثاني من تلك المنحنيات لرسم بياني التسارع مقابل الزمن (الشكل 5). فإنه من المستحسن أن تبقي النظام متعدد الحدود عند أدنى مستوى ممكن مع الحفاظ مناسبا. أمر متعدد الحدود الدنيا أقل يشير التباين في تسارع مع مرور الوقت. شروط متعدد الحدود العليا سوف يكون النظام يكاد يذكر، وبالتالي لا لزوم لها، إذا كان النظام من متعدد الحدود عالية جدا. يتباطأ هذه الدودة بمعدل ثابت من 0.110 ملم / ثانية 2 ± 0.002 ملم / ثانية 2، يستدير ويسرع في نفس المعدل 0.110 ملم / ثانية 2 ± 0.002 ملم / ثانية 2 حتى بعد فترة وجيزة نقطة تحول. وC. تواصل ايليجانس التحرك إلى الأعلى مع تسارع تناقص 1،252-،00708 ر مم في / ثانية 2 حتى يسقط التسارع من الصفر. مع الأخذ في الاعتبار المعادلة. 3، وكتلة دودة تقدر ب 3 & #956؛ غرام، الدودة يخضع لقوة صافية العمودي، F نيويورك، من 0.33 السندات الإذنية حتى بعد فترة وجيزة من نقطة تحول. النسب: هناك ثلاثة أنواع من القوى المؤثرة على الدودة حتى يصل إلى نقطة تحول دودة: الجاذبية، جر، الطفو والتوجه (الشكل 6A). القوة صافي يساوي مجموع ناقلات لجميع القوى الثلاث. نحن هنا النظر في مكونات العمودية فقط: F ني = F + F دي تاي-F + F ز ب (4) حيث F هي القوة B الطفو. F ز تساوي في حجمها ولكن العكس في الاتجاه للقوة الطفو على افتراض أن كثافة الدودة هو أن من الماء. مكافئ. 4 ثم يمكن كتابتها على النحو التالي: F ني = F + F دي تاي (5) F ني يبقى ثابتا خلال النسب. هذا يعني أنF + F تاي دى لا تزال مستمرة حتى تصل إلى نقطة تحول الديدان الخيطية. F دى هو أكبر في الجزء العلوي، والذي هو بداية الطريق، ويقلل تدريجيا إلى الصفر حتى سرعة الصفر عند نقطة تحول حين F تاي يجب زيادة للحفاظ F ني ثابتة. التحول: ليس هناك قوة السحب في الاتجاه الرأسي عند نقطة تحول منذ السرعة الرأسية يساوي الصفر عند تلك النقطة. القوات الوحيدة التي تعمل في الاتجاه الرأسي هي الجاذبية، و- F ز، الطفو، F B والتوجه دودة العمودي، F تاي، كما هو مبين في الشكل 6B. عند هذه النقطة، وفحوى C. يمكن تحديد ايليجانس: F = F تاي ني (6) التوجه في الجزء السفلي من المسار ومن ثم يساوي تقريبا 0.33 السندات الإذنية، وهي عبارة عن 0.001٪ من الوزن الدودة. مع الأخذ بعينالاعتبار أن الوزن المقدر، F ز من C. ايليجانس هو 28 ن ن، الصعود: وبالمثل، أثناء الصعود، ولكن الزيادات السحب وأشار إلى أسفل (الشكل 6C): F ني =-F + F دي تاي (7) يجب أن يكون التوجه تنفذها دودة حتى الآن أكبر ويساوي مجموع قوة السحب والوزن. الدودة يتباطأ بعد بداية لحمام السباحة. السباحة حتى في نفس المعدل كما ينحدر الدودة، فإن الدودة يجب أن تمارس الاتجاه التصاعدي لمرتين على الأقل وزنه. تحليق ويرد مثال على الدودة التي تبطئ هبوطه لمدة 3 ثانية في الشكل 7. A متعدد الحدود 3 درجة الثالثة هي نوبة معقولة للمسار العام. الأخطاء في التسارع والسرعة من هذا مناسبا هي أقل من 15٪. يبدأ دودة مع upwa كبيرة التوجه الثالث، يبطئ ويبدأ في الالتفاف في 68 ثانية؛ ومع ذلك، يقلل من التسارع الصعودي مستمر (الشكل 8) حتى يساوي تسارع صافي الصفر حوالي 68.5 ثانية. وهذا يؤدي في النهاية إلى تسارع صافية في الاتجاه الهبوطي تليها نقطة الصفر آخر في سرعة (الشكل 9) والديدان الخيطية يبدأ في النزول مرة أخرى في 69 ثانية. ومن المثير للاهتمام أن الحد الأقصى لوحظ تسارع العمودي في هذه الحالة هو 2.7 ملم / ثانية 2. تسارع في نقطة تحول هي 0.455 ملم / ثانية و 2 – 0.455 ملم / ثانية 2 على التوالي؛ حوالي أربع مرات أكبر مما كانت عليه في حالة الديدان الخيطية التي يستدير وتسبح فوق. باستخدام المعادلة. 6، فإنه يمكن تقدير أن الاتجاه التصاعدي حوالي 1.32 السندات الإذنية في نقطة تحول أولا. في نقطة تحول ثانية، تسارع الصافي هو سلبي بحيث الاتجاه التصاعدي هو 1.32 السندات الإذنية. الشكل 1. الإعداد التجريبية. الليزر، وشعاع المتوسع، والعدسة والشاشة هي ضرورية لإعداد التجريبية. قد يتم حذف المرايا التوجيه والثقوب، ولكن سوف تجعل المحاذاة البصرية أقل استقرارا. ومن المتوقع الرقم 2. صورة واحدة الطول الموجي الظل (SWSI). باستخدام 2 ميغاواط من 543 نانومتر ضوء الليزر ظل دودة على شاشة. هو مقلوب الصورة بحيث تظهر الديدان الخيطية في الانخفاض صعودا. 424/51424fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/> الرقم 3. عمودي النسب من wildtype جيم واحد ايليجانس في عمود الماء. كان مظلل هذه الديدان الخيطية من خلال 633 نانومتر ضوء متماسكة. المنحدر من نوبة خطي يشير إلى سرعة الهبوط من 1.09 ملم / ثانية ± 0.01 ملم / ثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. الرسم البياني النزوح من واحد إلى أعلى السباحة wildtype C. ايليجانس. اثنين من نوبات محزوزة تتبع مسار الشامل من الديدان الخيطية. المشتق الثاني من صالح يكشف عن التسارع. يتم تحديد الحد الأقصى لتسريع بسهولة من نوبة الأولى: 0.110 مم / ثانية 2 ± 0.002 ملم / ثانية 2. يتم عرض سوى عدد قليل من أشرطة الخطأ بحيث تظل نقاط البيانات وتناسب مرئية. وقد تعقبت هذه الديدان الخيطية من خلال 633 نانومتر ضوء متماسكة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5. تسريع الرسم البياني لwildtype جيم واحد ايليجانس. يحافظ على هذه الديدان الخيطية تسارع الصعودي مستمر من 0.110 ملم / ثانية 2 ± 0.002 ملم / ثانية 2 الامر الذي ادى الى ابطاء ثم التحرك صعودا. بعد فترة وجيزة من نقطة التحول يقلل من تسارع مطرد وتسارع صافي يقلل إلى الصفر. ز "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرسوم البيانية الشكل 6. قوة للأصل، نقطة وصول. الطفو والجاذبية تحول متساوون في المقدار ومضاد له في الاتجاه بحيث تأثير هذه القوى يلغي كل منهما الآخر. ولذلك لا يظهر أنها في هذه المخططات. (أ) دودة ينحدر مع السحب والتوجه إلى الارتفاع. (ب) الدودة هو عند نقطة منخفضة من مسار دون السحب. التوجه إلى الارتفاع. (ج) دودة تصاعدي مع السحب إلى الانخفاض في حين التوجه إلى الارتفاع. "سرك =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/> الرقم 7. الرسم البياني النزوح من الديدان الخيطية تحوم احد. يبطئ الدودة أسفل ويبدأ بدوره حولها في حوالي 68 ثانية ولكن يبدأ تنازلي حول 69 ثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. . الرقم 8 تسريع الرسم البياني من الديدان الخيطية تحوم احدة تبدأ هذه الدودة مع تسارع الصعودي من 2.7 ملم / ثانية 2، تنخفض إلى الصفر، ولها التسارع من الهبوط في نهاية المطاف – 2.6 ملم / ثانية 2 الرجاء انقر هنا لعرض أكبر قيود التصدير الطوعيةايون من هذا الرقم. الرقم 9. الرسم البياني السرعة من الديدان الخيطية تحوم احد. تأتي هذه الدودة إلى توقف في 68 ثانية ويبدأ في التوجه التصاعدي، ويبطئ سرعة تصل إلى الصفر في الاتجاه العمودي في 69 ثانية تليها النسب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1. سرعات النسب متوسط N2 C. ايليجانس. وآر 50 و 50 حي الديدان الخيطية القتلىacked خلال النسب. متوسط سرعة النزول لهو نفسه ليعيش والديدان الميتة: 1.5 ملم / ثانية ± 0.1 ملم / ثانية.

Discussion

توفر تقنية SWSI وسيلة إضافية لفهم قدرات الحركي من الكائنات الحية المجهرية مثل الديدان الخيطية حرة المعيشة. مع هذه التقنية لقد ميز بين تحرك نشط (السباحة) والانجراف السلبي بسبب الجاذبية تعمل على الديدان الخيطية القتلى. بالإضافة إلى ذلك، عند تغيير الديدان الخيطية السباحة الحرة الاتجاه خلال تحرك في الماء، ونحن قادرون على قياس سحب القوات وقوات الزاوي، والتي تعمل على الديدان الخيطية والديدان الخيطية التي تمارس من قبل.

الديدان الخيطية تواجه الظروف البيئية المختلفة داخل التربة. هناك جيوب المياه داخل التربة، وكذلك الجسيمات الصلبة والمواد البيولوجية من مختلف الأشكال والقوام. بالإضافة إلى ذلك، توجد الديدان الخيطية ضمن بيئة الجاذبية التي تستجيب إلى ^14. علاوة على ذلك، تتعرض الديدان الخيطية بالقرب من سطح التربة لأطوال موجية مختلفة من الضوء، والتغيرات في درجات الحرارة والرطوبة، وكذلك البيولوجيةالمتغيرات مثل البكتيريا والفطريات والكائنات الحية المفترسة التربة الأخرى. يجب الديدان الخيطية الرد على كل هذه المتغيرات المختلفة، والسباحة والزحف في وسائل الإعلام المختلفة، وتحول وتغيير الاستراتيجيات الملاحية. وتتم كل هذه العمليات الحسابية المعقدة من قبل الخلايا العصبية فقط 302، مجموعة فرعية من التي تشارك في تحرك، و 95 هيئة خلايا العضلات الجدار. قياسات من النوع الذي وصفه تقنية SWSI تقديم نظرة متبصرة في كيفية الديدان الخيطية إنجاز هذا التعقيد الملاحية.

بالنسبة للجزء الأول، قمنا بقياس معدل تنازلي العام للwildtype C. ايليجانس في ضوء 633 نانومتر. باستخدام هذه القياسات، ونحن يمكن تقدير قوة السحب لقاءات دودة.

لدراسة حالة الديدان الخيطية تسريع، تشارك قوات تغير مستمر منذ التغييرات قوة السحب مع السرعة. هناك بعض التصريحات التي نحن قادرون على جعل عن القوى المؤثرة على دودة. مع تباطؤ الدودة أسفل ويحاول SWايم صعودا المكون العمودي للقوة السحب يقلل حتى يصل إلى الصفر عند نقطة منخفضة من مسار الديدان الخيطية و. عند هذه النقطة، يجب أن يكون دودة قوة التصاعدي لحمام السباحة.

هذا الأسلوب يمكن تعديلها بطرق عديدة. يمكن تتبع أي الأنواع المجهرية التي يتنقل في سائل واضحة باستخدام SWSI. ويمكن إجراء دراسات مع أي موجات التي هي في متناول الكاميرات الرقمية. والكاميرات الرقمية اختيار عادة ما يصل أطوال موجية تتراوح بين الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء إلى قرب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات الأفقي من خلال توجيه الليزر عموديا إلى أعلى. ويمكن بعد ذلك أن توضع الأنواع على سطح شفاف الأفقية، مثل شريحة المجهر. يمكن ضبط المتوسع شعاع عدسة مكبرة أو بعد المتوسع شعاع شحذ الصور الباهتة. يجب أن يكون المستخدم التأكد من ربط جميع المكونات الى طاولة المفاوضات لضمان اتساق وسهلة محاذاة شعاع.

طريقة محدودة بسبب طول الموجة الليزر المتاحةالنظام المنسق والقرار. في جوهرها مزايا هذه الطريقة على المجاهر القائمة، والتي هي المرونة في اتجاهات وموجات، هي أيضا نقاط الضعف منذ الإعداد بسيطة. البصريات وبقع غير متطورة من الليزر تحد من القرار. بعض من هذه العيوب يمكن بالتأكيد أن تتحسن في المستقبل بما في ذلك عن طريق تصفية المكانية وإبراز الصورة مباشرة على كاميرا CCD.

يمكن بسهولة أن تعلم الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول كما يتم إجراء التجربة للمرة الأولى. وضع الديدان الخيطية في كفيت دون خلق الاضطراب أمر بالغ الأهمية. أيضا، قد الاهتزازات تخل الإعداد وتغيير سلوك الديدان. ومن المؤكد أن تحد من السلطة، والذي يستخدم لخيال الصورة. وينبغي أن تكون 2 ميغاواط لشعاع الليزر الذي هو 1 ملم في القطر الحد الأقصى لتجنب الآثار التدفئة. وينبغي اختبار الإعداد لنثر الآثار عند استخدام سوائل أخرى من الماء المقطر.

حاليا معظم مicroscopes تعمل على المستوى الأفقي باستخدام الضوء أو اللون الأبيض المرشحات، والتي لا تزال واسعة جدا في النطاق الموجي. المجاهر التي تستخدم موجات حقا واحدة ولها المرونة في السيناريو عرض، أي وضع أفقي، وعادة ما تقتصر على ميزة واحدة أو أخرى. أيضا، هذه الأنواع من المجاهر وعادة ما تكون مكلفة للغاية والتي لا تزال تقتصر على طائرات التنسيق على عكس أسلوب لدينا. ويمكن بسهولة أن يبنى الإعداد لدينا بميزانية منخفضة للغاية. هذا الأسلوب هو على استعداد لاستخدامها من قبل المدارس والشركات البيئية فضلا عن غيرها من الكيانات التي تعمل مع التمويل الصغير. في المستقبل، وهذه الطريقة يمكن استخدامها في إعداد متطورة جدا لدراسة الآثار في الوقت الحقيقي على تحرك وmechanosensation الأنواع المجهرية. هذا الأسلوب يجعل الدراسات الطول الموجي واحد في مجموعة واسعة من الزوايا والأعماق المشاهدة متاحة بسهولة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للدعم معهد بحوث كلية فاسار الجامعية الصيفية (URSI)، وصندوق بحوث سمك السلمون لوسي ماينارد، جائزة وكالة ناسا رقم NX09AU90A، مركز المؤسسة الوطنية للعلوم من أجل التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا (NSF-كريست) جائزة رقم 0630388 ورقم 1058385 جائزة جبهة الخلاص الوطني.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm	Thorlabs	LA1257

References

Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).
Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
Keller, H. E., Pawley, J. B. . Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. , (2011).
Demtröder, W. . Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).
Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).
Mood, A., Graybill, F., Boes, D. . Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).
Taylor, J. R. . Classical Mechanics. , (2005).
Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
Bevington, P. R. . Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).
Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).
Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O’Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

Automatically Generated