Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Alicia Jago; Tewa Kpulun; Kathleen M. Raley-Susman; Jenny Magnes

doi:10.3791/51424

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Engineering

אחת אורך גל צל הדמיה של Elegans Caenorhabditis נידות כולל כוח אומדנים

Published: April 18, 2014

doi:

10.3791/51424

Alicia Jago¹, Tewa Kpulun¹, Kathleen M. Raley-Susman², Jenny Magnes¹

¹Physics and Astronomy Department,Vassar College, ²Biology Department,Vassar College

Summary

הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומינים שונות כדי למדוד את הכיוון, מהירות, תאוצה וכוחות.

Abstract

מחקר זה מדגים טכניקה זולה ופשוטה המאפשרת המדידה של תכונות פיזיות כגון מיקום, מהירות, תאוצה וכוחות מעורבים בהתנהגות locomotory של נמטודות המושעית בעמודת מים בתגובה לאורכי גל בודד של אור. אנו מדגימים כיצד להעריך את התנועה של האורגניזם מיקרוסקופי באמצעות יחיד אורך גל צל הדמיה (SWSI) באמצעות שתי דוגמאות שונות.

הדוגמא הראשונה היא מחקר שיטתי ובר קיימא מבחינה סטטיסטית של הירידה הממוצעת של ג elegans בעמודת מים. במחקר זה, שהשתמשנו חיים וג wildtype המת elegans. כאשר השווינו את המהירות וכיוון התנועה פעילה נמטודות עם מוצא הפסיבי של תולעים מתים בתוך השדה כבידה, מחקר זה לא הראה שום הבדל במוצא-פעמים. הירידה הממוצעת הייתה 1.5 מ"מ / שנייה ± 0.1 מ"מ / שנייה עבור שניהם את התולעים חיים ומתים באמצעות 633 ננומטר קוהרנטיתאור.

הדוגמא השנייה היא מקרה של ג פרט בחר elegans שינוי הכיוון במהלך הירידה בעמודת מים אנכית. תאוצה וכוח הם נותחו בדוגמא זו. מקרה זה מדגים את ההיקף של תכונות פיזיות אחרות שיכול להיות מוערכת באמצעות SWSI תוך הערכת ההתנהגות באמצעות אורכי גל יחיד בסביבה שאינה נגיש לעם מיקרוסקופים מסורתיים. שימוש בניתוח זה אנו מוערכים נמטודות אדם מסוגלת לדחוף בכוח עודף של 28 NN.

הממצאים שלנו מצביעים על כך שנמטודות חיים להפעיל 28 ננ בעת ההפעלה, או ההעברה נגד השדה הכבידה. הממצאים מראים עוד כי נמטודות יורדת באופן פסיבי בעמודת מים, אך באופן פעיל יכולים להתנגד לכח הכבידה בעיקר על ידי הפיכת כיוון.

Introduction

elegans Caenorhabditis הוא נמטודות קרקע מועילות חיים חופשיות שהיא אורגניזם מודל רב עוצמה ללימוד מנגנונים של ויסות הגנים, פיתוח ולאחרונה להבנת ביולוגיה והתנהגות חושיות. למרות שיש רק 302 נוירונים, ג elegans מסוגל תבניות מורכבות locomotory, התנהגויות רבייה, ניווט, chemotaxis והרבה התנהגויות אחרות. ג elegans להחזיק מכאני, chemoreceptors ואפילו לזהות אורכי גל כחולים של אור (וורד et al. 2008) ^1. בעוד הרבה ידוע על המעגלים העצביים של תפקוד חושי ודפוסי locomotory כלליים בג elegans, פחות ידוע על התגובות לגירויים מרובים, בו זמנית, או תנאי סביבה מורכבים יותר ממה יכול להיות מודל תחת מיקרוסקופ. כמה מחקרים גילו דפוסי locomotory מורכבים יותר, כי הם ^2,3,4 פלסטיק מאוד. הגישה המתודולוגית שלנו תאפשר לימודים של nematodes בפתרון בזמן אמת שבו אנחנו בקלות יכולים לספק תנאי סביבה מרובים בו זמנית. שאלה זו קשה לתת מענה תוך שימוש בטכניקות הדמיה המבוסס על מיקרוסקופ קונבנציונליות. פיתחנו טכניקת הדמיה המאפשרת לנו למקם את נמטודות בתוך עמודת מים לבחון התנהגויות locomotory, כמו גם לקבוע את היכולות של נמטודות לשנות תנועה בתגובה לתנאים סביבתיים שונים.

אורך גל יחיד צל ההדמיה (SWSI) מוצגת במאמר זה בפעם הראשונה כדי לענות על החסרונות של מיקרוסקופים מסורתיים. מיקרוסקופים מסורתיים מוגבלים לתצפיות במינים במישור מוקד אופקי מיקרונים אחדים בעומק ^5,6. לגבי מחקרי אורך גל יחיד, רוב מיקרוסקופים מסורתיים להשתמש במסנני צבע כדי לסנן אור לבן באופן כללי מאוד, בדרך כלל, ננומטר 50-100. שימוש בליזר לSWSI מצמצם את בחירת אורך הגל לננומטר פחות מ 1, תוך שמירה על סימןעוצמת אור ificant ^7. באופן דומה, באורכי גל בודדים היה בשימוש כדי למדוד תדרי חייה של ג elegans בזמן אמת ^8.

להפגנה הראשונה של השיטה שלנו, אנו עוקבים אחר המצב האופקי, x, והמצב האנכי, y, של ג שוחה בחופשיות elegans בעמודת מים, על פני מרחק של כ סנטימטר. בפרט, אנו מעוניינים בתנועה האנכית מאז הכבידה פועל גם בצורה אנכית. שיפוע ליניארי מתאים למצב האנכי נותן את המהירות האנכית, _y v, של נמטודות כפי שהוא יורד בעמודת המים:
(1)

שורש ממוצע ריבוע של השגיאה (RMSE) ⁹ מציין את האיכות של הכושר ומציין אם המהירות יורד בדרך כלל קבועה. אז המהירויות האנכיות בממוצע לEACמיני שעות ותולעים מתים. שימוש בתוצאות הללו, דראג, שניסיון התולעים יכול להיות מוערך.

להפגנה השנייה של השיטה שלנו, בחרנו ג elegans שלא ירד בקצב קבוע שלא כמו רוב התולעים שנצפו. התולעים שנבחרו או הסתובבו ושחו כלפי מעלה או ריחפו במשך זמן מה לפני שאמשיך בירידה. מבחינה פיזית, מקרה זה מראה שהדחף של מיקרואורגניזם שחייה יכול להיות מחושב. חוקי ניוטון להכתיב כי גוף שמשנה כיוונים מאיץ, מה שמרמז על כוח שקול, , הוא הפועל על הגוף ^ש10:
(2)

איפה הואאת המומנטום ולא ליניארי הוא זמן. ההאצה של התולעת עומד ביחס ישר לכח הפועל על התולעת מאז המסה של התולעת נשארת קבועה. כתוצאה מכך, הכח השקול האנכי הוא:
(3)

כאשר m הוא המסה של תולעת _וy מייצג את התאוצה האנכית. הכח השקול בכיוון האנכי מייצג אז דחף התולעת באותו הכיוון. הדחף הכולל ניתן לחשב על ידי לקיחת הרכיב האופקי בחשבון.

Protocol

1. ג elegans הכנה הכן את צלחות פטרי של ג בוגרים הצעיר elegans כמתואר בניסויים קודמים מעורבים השעיה של ג elegans בקובט מלא נוזל 11. ביום של ניתוח וידאו, לבחור נמטודות מבוגרים צעירה חי ישירות לתוך קובט מלא במים deionized, מזוקקים באמצעות איסוף פלטינה כפי שמתואר בשלב 2. הכן מת ג elegans עם חשיפת כלורופורם. המשך על ידי ביצוע ההליך המתואר לקטיף נמטודות החי מתוארת בשלב 2. 2. התקנה אופטית לניתוח הווידאו להרכיב את ההתקנה הניסיונית ליצירת תמונות צל כפי שמוצג באיור 1. המצלמה יכולה להיות ממוקמת בכל מרחק מהמסך, כל עוד הוא מסוגל ללכוד תצוגה קדמית של המסך. מקום טוב ליד קובט מול המסך. שימוש בלפחות שתי מראות כדילנווט את פלט לייזר הליום הניאון מתכונן להרחבת קרן גלילית, כך שהקרן מורחבת לקוטר של 12 מ"מ. הנח נקבים אחד או שניים בנתיב הקרן, כך שהקרן עוברת דרך הנקבים בלי להיות מוסתר. השתמש בנקבים כדי להבטיח נשמר היישור. כוון את האלומה התרחבה על קובט קוורץ רכוב שהוא 10 מ"מ רחב, 10 מ"מ עמוק ו4 סנטימטר. להגדיל את הקרן באמצעות עדשת Plano-קמור עם אורך מוקד חיובי של 75 מ"מ. הנח מסך הקרנה כ 120 סנטימטר מהעדשה. מרחקים גדולים מזו יניבו ההגדלה גדולה יותר של תמונת הצל. עם זאת, האיכות של התמונה תקטן עם עוצמת אור נמוכה וnoticeability מוגבר של הפרעות עקיפה. הצב מצלמה במהירות גבוהה, אשר מסוגלים לפחות 60 fps, ממש ליד קובט מול המסך. הנח מיקרוסקופ לנתח ליד הסט האופטיעד להעברה מהירה של נמטודות לקובט. באופן זמני לאבטח שליט שקוף עם חטיבות מ"מ למרכזו של בעל קובט בניצב לקרן הורחבה כך שהפרויקטים קורה תמונה מוגדלת של השליט על גבי המסך. הגדר את קנה המידה האורך לניתוח וידאו. במסך ההקרנה, לסמן את המרחק בקנה מידה באמצעות סרגל שקוף מחוץ למרכז מהתמונה המוקרנת, כדי למנוע הפרעה להקרנה. לחץ כאן לוידאו. הקלט את התמונה ולמדוד את ההגדלה. הסר את השליט מההתקנה. חזור על שלב זה עבור אורכי גל אחרים כמו זווית השבירה של אור לכל אורך גל דרך העדשה ישתנה בשל סטיות כרומטי. החלף את קובט ולמלא אותו עד למרחק של 1 מ"מ של השפה עם מים מזוקקים. להתחיל את ההקלטה בזמן שהאור בחדר הוא בכך שהמרחק בקנה מידה כלול באותומדה כתמונה המוקרנת. כבה את האור. באמצעות איסוף דק, שטוח חוט פלטינה, להעביר מבוגרים צעירים בודדים ג elegans אחד בכל פעם מהצלחת אגר לקובט ידי נגיעה בבחירה אל פני השטח של המים. נמטודות תהיה גלויה בעמודת המים כאשר הוא נכנס לקרן בשל אור מפוזר. לחץ כאן לוידאו. לצלם את התמונות המוקרנות של התולעים כשהם עוברים דרך קרן הלייזר המורחבת. חשוב לציין כי התמונה המוקרנת היא הפוכה והתולעים יופיעו לנוע בכיוון ההפוך של התנועה שלהם בפועל. תולעים שהם יורדים עם כוח הכבידה יופיעו לנוע כלפי מעלה על המסך (איור 2). 3. וידאו נתונים הכנה ייבא את הווידאו לתכנית ניתוח וידאו. הגדר את קנה המידה באמצעות גורם הגדלה נקבע בעבר. Track העקירה ליניארי של ראש נמטודות המוצלת עם לפחות 10 נקודות נתונים על כל הדרך שעשתה. מצא את המהירות בכיוון האנכי על ידי לקיחה נגזרת ("Y", "זמן") ולחלק את הערך זה על ידי גורם הגדלה קבע בשלב 2.2. 4. ניתוח נתונים לנתח את הירידה ליניארית של ג elegans: בדוק כדי לוודא שנקודתי נתונים במצב האנכי לעומת גרף זמן, בדרך כלל בצורת קו ישר. ניתן להתעלם ממנו סטיות מסוימות בשל תנועת הראש של נמטודות. אם נקודות נתונים בדרך כלל בצורת קו ישר, המשיכו לשלב 4.1.2, אחרת הירידה אינה ליניארית והניתוח צריך להיות המשך באמצעות צעד 5.1 בפרוטוקול זה. ליצור קו רגרסיה ליניארית על ידי התאמת קו ישר 12 לנתונים מתפריט ניתוח. השיפוע של קו זה הוא אז את המהירות האנכית של ה-C.elegans. המדרון הוא השינוי בעמדה מחולק בשינוי בזמן על מרווח מסוים. לקבוע את המהירות יורד מתולעי חיים ומתים באופן זה (איור 3). ממוצע מהירויות השחייה האנכית מנמטודות. גודל מדגם של כ 50 תולעים מספיק. השוואה מהירויות השחייה בתולעים חיים עם מהירויות סחיפה בתולעים מתים. 5. לנתח קוי Motion של ג elegans מסעיף 3, בחר קובץ וידאו ניתח, אשר מראה ירידה קוי בתוך עמודת המים (איור 4). ירידה קוי יכולה להיות מזוהה באמצעות צעד 4.1.1 בפרוטוקול זה. בחר "Curve Fit" מהתפריט "ניתוח" בתוכנת ניתוח וידאו. בחר סדר שני פולינום (מהמעלה השנייה). להתאים את העקומה. לאזור של עניין, להתאים את הכושר על הגרף על ידי הזזה בסוגריים בכל צד of הכושר על הגרף עד העקומה הוא קרוב מאוד לנקודות נתונים בכושר ו / או גם בתוך סורגי השגיאה. התכנית הראויה נותנת ביטוי מתמטי לעקומה המצויד, שהוא מצב אנכי לעומת זמן. קחו למשל את השגיאות העקומה מצוידים ניתנו על ידי התכנית משויכת לתכונות פיזיות. שגיאה היחסית של 15% או מתחת היא בדרך כלל מתקבל על הדעת. הוסף עוד עקומה מתאימה לכיסוי קטעים נוספים של הנתונים. שגם 13 הפונקציות לכיסוי אופטימלי: לוודא כי העקומה המתאימה חפיפה ולנסות ליישר עקומות סמוכות, כך שמשחק מדרונות באזורים החופפים. השג את המהירות לאזור של עניין על ידי לקיחה הנגזרת של העקומה המצויד באמצעות הביטוי המתמטי שהושג בשלב 5.1.3. מהירויות עשויות להשתנות בזמן. שים לב כי הנגזר הוא השיפוע של פונקציה. ניתן להשיג נגזר מבחינה מתמטית או באופן גרפי. במקרה זה זה מעשי להשתמש expr המתמטי נתוןession. קח את הנגזרת השנייה של העקומות מצוידים כדי לקבל התאוצה. ההאצה עשויה להשתנות בזמן. הכפל את האצה על ידי מסת התולעת כדי לחשב את הדחף, המפעילה את התולעת. מסה המשוערת סבירה היא 3 מיקרוגרם בהנחה שהתולעת מורכבת בעיקר ממים.

Representative Results

Descent היציב החקירה הראשונה מראה שום הבדל להבחין בשיעורי יורד מג elegans במהלך SWSI באמצעות 633 ננומטר. השיעורים יורד נמצאו קבוע ב1.5 מ"מ / השני ± 0.1 מ"מ / השני לחיים וג מת שניהם elegans. גודל מדגם של 50 תולעים שנוצר שונות סבירות של 7% לשניהם חיים ותולעים מתים. אין תאוצה הפועלת על התולעים שכן המהירות יורד הוא קבועה, כך שהכח הגרר שווה לכוח הכבידה מינוס כוח העילוי. משמעות הדבר הוא כי הצפיפות של התולעת היא מעט גדולה יותר מזה של מים; עם זאת, להערכות שמתחתיו הוא עדיין מעשי להניח שהצפיפות של נמטודות היא בערך זה של מים. כיוון שינוי החקירה השנייה, מקרה מבחן, מוכיחה כי נמטודות מסוגלות לשנות כיוון ויכולות לשחות כלפי מעלה נגדכוח הכבידה. שתי עקומות הותאמו לתזוזה האנכית של נמטודות, כך שנגזר השני של עקומות אלה יכולים להיות splined גרף תאוצה לעומת זמן (איור 5). רצוי לשמור על סדר הפולינום נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על כושר טוב. סדר הפולינום נמוך מצביע פחות וריאציה בתאוצה לאורך זמן. מבחינת פולינום מהסדר גבוה יותר יהיה זניח, ולכן מיותר, אם הצו של הפולינום הוא גבוה מדי. תולעת זו מאיטה בקצב קבוע של 0.110 מ"מ / שנייה 2 ± 0.002 מ"מ / שנייה 2, מסתובבת ומאיץ באותו קצב 0.110 מ"מ / שנייה 2 ± 0.002 מ"מ / שנייה 2 לזמן קצר לאחר נקודת התפנית. ג elegans ממשיך לנוע כלפי מעלה בתאוצה הולכת ופוחתת של 1.252-.00708 לא במ"מ / השני 2 עד ההאצה נופלת לאפס. שמירה על Eq נפש. 3, ומסת תולעת המשוערת של 3 & #956; גרם, התולעת עוברת כוח אנכי נטו, F Ny, של 0.33 pN עד זמן קצר לאחר נקודת התפנית. Descent: ישנם שלושה סוגים של כוחות הפועלים על התולעת עד התולעת מגיעה לנקודת התפנית: כבידה, גרר, כוח העילוי ודחף (איור 6 א). הכח השקול שווה לסכום הווקטורים של כל שלושת הכוחות. כאן אנו רואים את המרכיבים האנכיים בלבד: F Ny = G F Dy + F Ty-F + F B (4) כאשר F B הוא כוח העילוי. ו ז שווה בגודל אך הפוך בכיוון לכוח העילוי בהנחה שהצפיפות של התולעת היא זה של מים. EQ. 4 אז יכולים להיות כתובים באופן הבא: F = Ny F Dy + F טאי (5) F Ny נשאר קבוע במהלך הירידה. משמעות הדבר הוא כיF Dy + F טאי נשאר קבוע עד לנמטודות מגיעה לנקודת המפנה. F Dy הוא הגדול ביותר בחלקו העליון, המהווה את תחילתו של השביל, ומפחית בהדרגה לאפס עד למהירות היא אפס בנקודת התפנית ואילו F טיי חייב להגדיל כדי לשמור קבוע F Ny. תפנית: אין כוח גרר בכיוון האנכי בנקודת התפנית מאז את המהירות האנכית שווה אפס בשלב זה. רק הכוחות הפועלים בכיוון האנכי הם כוח הכבידה, – g F, ציפה, F B ודחף התולעת האנכי, F טאי, כמתואר באיור 6 ב. בשלב זה, הדחף של ג ניתן לקבוע elegans: F = F טאי Ny (6) הדחף בחלק התחתון של המסלול הוא אז שווה פחות או יותר ל0.33 PN, שזה בערך 0.001% מהמשקל של התולעת. אם ניקח בחשבון שהמשקל המשוער, G F של ג elegans הוא 28 NN, אסנט: בדומה לכך, במהלך העלייה, עליית דראג אבל הוא הצביע כלפי מטה (איור 6 ג): F = Ny-F Dy + F טאי (7) הדחף מיושם על ידי התולעת חייב עכשיו להיות אפילו גדול יותר ושווה לסכום של כוח הגרר והמשקל. התולעת היא להאט לאחר מתחיל לשחות. לשחות עד באותו קצב כמו התולעת ירדה, התולעת הייתי צריכה להפעיל דחיפה כלפי מעלה של לפחות פעמיים במשקל שלה. רחיפה דוגמא לתולעת שמאטה את הירידה שלה לשנייה על 3 מוצגת באיור 7. פולינום תואר 3 rd הוא בכושר סביר לשביל הכולל. השגיאות בתאוצה ומהירות מכושר זה הן פחות מ 15%. התולעת מתחילה עם upwa משמעותי דחף rd, מאט ומתחיל להסתובב ב68 שניות; עם זאת, ההאצה כלפי מעלה יורדת ברציפות (איור 8) עד ההאצה נטו שווה לאפס סביב 68.5 שניות. זה סופו של דבר מוביל להאצה נטו בכיוון מטה ואחריו אפס נקודה אחרת במהירות (איור 9) ונמטודות מתחילה לרדת שוב ב69 שניות. זה מעניין, כי את התאוצה האנכית שנצפתה המקסימלי במקרה זה היא 2.7 מ"מ / שנייה 2. ההאצה בנקודות המפנה הן 0.455 מ"מ / השני 2 ו – 0.455 מ"מ / שנייה 2, בהתאמה; כארבעה פעמים גדולות יותר מאשר במקרה של נמטודות שמסתובבת ושוחה למעלה. באמצעות EQ. 6, זה ניתן להעריך כי הדחיפה כלפי מעלה היא כ 1.32 pN בנקודת המפנה הראשונה. בנקודת המפנה השנייה, האצה נטו היא שלילית, כך שהדחיפה כלפי מעלה היא 1.32 PN. איור 1. התקנה ניסיונית. הלייזר, ההרחבה קרן, העדשה והמסך הם חיוניים להגדרת הניסוי. מראות ההיגוי והנקבים עלולות להיות מושמטים, אבל יעשו את היישור האופטי פחות יציב. איור 2. תמונת יחידה אורך גל צל (SWSI). באמצעות 2 mW של 543 אור לייזר ננומטר הצל של תולעת מוקרנת על מסך. התמונה היא הפוכה, כך שנמטודות מופיעה ליפול כלפי מעלה. "Src =" 424/51424fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/> איור 3. אנכי ירידה של ג wildtype אחת elegans בעמודת מים. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. שיפוע המתאים ליניארית מצביע על מהירות כלפי מטה של 1.09 מ"מ / השני ± 0.01 מ"מ / השני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. גרף תזוזה של ג wildtype בודד כלפי מעלה שחייה elegans. שני התקפי splined לזהות את הנתיב הכללי של נמטודות. הנגזרת השנייה של הכושר מגלה את התאוצה. ההאצה המרבית נקבעה בקלות מההתקף הראשון: 0.110 מ"מ / השני 2 ± 0.002 מ"מ / שנייה 2. רק כמה ברים שגיאה מוצגים כך שנקודתי נתונים והכושר יישארו גלויות. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. גרף איור 5. ההאצה של ג wildtype אחת elegans. נמטודות זו שומרת על תאוצה כלפי מעלה קבועה של 0.110 מ"מ / השני 2 ± 0.002 מ"מ / שנייה 2 גורמת לו להאט ולאחר מכן להעביר כלפי מעלה. זמן קצר לאחר נקודת תפנית האצה יורדת בהתמדה והאצה נטו מפחיתה לאפס. g "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. תרשימי איור 6. חיל לירידה, נקודת מפנה ועלייה. חוק ארכימדס וכוח הכבידה שווים בגודל והפוך בכיוון, כך שההשפעה של כוחות אלה מבטלים זה את זה. לכן הם לא מוצגים בתרשימים אלה. () התולעת היא יורדת עם גרור ודחף כלפי מעלה. (ב) התולעת היא בנקודה של המסלול ללא גרר הנמוכה. הדחף הוא מצביע למעלה. (ג) התולעת עולה עם גרור כלפי מטה ואילו הדחף הוא כלפי מעלה. "Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/> איור 7. גרף תזוזה של נמטודות המרחפת אחת. התולעת מאטה ומתחילה להסתובב בכ 68 שניות אבל מתחילה יורדת סביב 69 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. .. איור 8 גרף ההאצה של נמטודות המרחפת אחת תולעת זו מתחילה עם האצה כלפי מעלה של 2.7 מ"מ / שנייה 2, יורדת לאפס וסופו של דבר יש לו תאוצה כלפי מטה של -. 2.6 מ"מ / שנייה 2 אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול יותריון של נתון זה. איור 9. גרף מהירות של נמטודות המרחפת אחת. תולעת זו מגיעה לעצירה ב68 שניות ומתחילה לעמוד בראש כלפי מעלה, מאטה ומגיעה למהירות אפס בכיוון האנכי ב69 שניות ואחריו ירידה. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו. טבלת 1. מהירויות ירידה ממוצעת של N2 ג elegans. 50 חיים ו50 נמטודות מתות tracked במהלך ירידתם. המהירות הממוצעת לירידות היא אותה לחיים ותולעים המתים: 1.5 מ"מ / השני ± 0.1 מ"מ / השני.

Discussion

טכניקת SWSI מספקת דרך נוספת להבין את יכולות locomotory של אורגניזמים מיקרוסקופיים כמו נמטודות חופשיות חי. בעזרת טכניקה זו יש לנו להבחין בין תנועה הפעילה (שחייה) והיסחפות פסיבית בשל כוח הכבידה פועל על נמטודות המתה. בנוסף, כאשר נמטודות שחייה חופשית לשנות כיוון בזמן תנועה במים, אנו מסוגלים למדוד את כוחות הגרר וכוחות זוויתי, הפועלים בנמטודות ומופעלים על ידי נמטודות.

נמטודות נתקלות תנאים סביבתיים שונים בתוך הקרקע. ישנם כיסי מים בתוך אדמה, כמו גם חלקיקים מוצקים וחומרים ביולוגיים של צורות ומרקמים שונים. בנוסף, נמטודות להתקיים בתוך סביבת הכבידה שהם מגיבים ^ל14. יתר על כן, נמטודות סמוך לפני השטח של האדמה חשופות לאורכי גל שונים של אור, שינויים בטמפרטורה ובלחות, כמו גם ביולוגימשתנים כמו חיידקים, פטריות טורפת ואורגניזמים אחרים באדמה. נמטודות חייבת להגיב לכל משתנים השונים אלה, שחייה וזחילה באמצעי תקשורת שונה, מפנה ושינוי אסטרטגיות ניווט. כל החישובים המורכבים הללו מבוצעים על ידי רק 302 נוירונים, קבוצת משנה של אשר מעורבים בתנועה, ו95 תאי קיר שרירים גוף. מדידות מהסוג שתואר על ידי טכניקת SWSI מספקות תובנה חשובה לתוך כיצד נמטודות להשיג מורכבות ניווט זה.

לחלק הראשון, יש לנו למדוד את קצב יורד הכולל של ג wildtype elegans ב633 ננומטר אור. שימוש במדידות אלה, אנחנו יכולים להעריך את כוח גרר מפגשי תולעת.

למקרה המבחן של נמטודות מואצת, הכוחות מעורבים שינוי ברציפות מאז כוח גרר השינויים במהירות. יש כמה דברים שאנו יכולים לעשות על הכוחות הפועלים על התולעת. כתולעת מאיטה ומנסה swim כלפי מעלה את הרכיב האנכי של כוח הגרר יורד עד שזה מגיע לאפס בנקודת המסלול של נמטודות הנמוכה. בשלב זה, את התולעת חייבת להיות כוח כלפי מעלה כדי לשחות למעלה.

שיטה זו יכולה להיות שונה בכמה דרכים. כל מינים מיקרוסקופיים שמנווט בנוזל שקוף ניתן לעקוב באמצעות SWSI. ניתן לבצע מחקרים עם כל אורכי גל שאינם נגישים למצלמות דיגיטליות. מצלמות דיגיטליות בדרך כלל יאספו את אורכי גל הנעים מ-UV אל IR הקרוב. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אופקיים על ידי הפניית הלייזר אנכי כלפי מעלה. אז יכולים להיות ממוקמים המינים על משטח שקוף אופקי, כמו שקופיות מיקרוסקופ. התאמת ההרחבה הקרן או בעדשת המגדלת אחרי ההרחבה הקרן יכולה לחדד תמונות מטושטשות. המשתמש צריך להיות בטוח כדי להדק את כל הרכיבים לשולחן, כדי להבטיח יישור קורה עקבי וקל.

השיטה היא מוגבלת על ידי wavelengt לייזר זמיןhs ורזולוציה. בעיקרו של דבר את היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופים קיימים, שהן הגמישות בכיוונים ואורכי גל, גם חולשות מאז ההתקנה היא פשוטה. אופטיקה והכתמים לא מתוחכמים של הלייזר מגבילים את הרזולוציה. כמה מהחסרונות הללו בהחלט יכולים להיות שיפור בעתיד על ידי כולל מסנן המרחבי ומקרין את התמונה ישירות על גבי מצלמה CCD.

בקלות ניתן ללמוד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כניסוי מתבצע בפעם הראשונה. הצבת נמטודות בקובט מבלי ליצור מערבולת היא קריטית. כמו כן, תנודות עלולות להפריע להתקנה ומשנות את התנהגותם של התולעים. הקפד להגביל את הכוח, המשמש לצל תמונה. 2 mW לקרן לייזר שהיא 1 מ"מ קוטר צריך להיות המקסימאלי כדי למנוע תופעות חימום. ההתקנה צריכה להיבדק לפיזור לוואי בעת שימוש בנוזלים אחרים מלבד מים מזוקקים.

רוב מ 'נכון לעכשיוicroscopes פועל על מישור אופקי באמצעות מסנני אור או בצבע לבן, שהם עדיין רחבים מאוד בטווח אורכי הגל. מיקרוסקופים שבאמת משתמשים באורכי גל בודדים ויש לי גמישות בתרחיש הצפייה, כלומר מיקום אופקי, מוגבלים בדרך כלל לטובה אחד או אחרת. כמו כן, אלו סוגים של מיקרוסקופים הם בדרך כלל יקרים מאוד ועדיין מוגבלים למטוסי מוקד בניגוד לשיטה שלנו. ההתקנה שלנו בקלות יכולה להיות בנויה עם תקציב נמוך ביותר. שיטה זו היא מוכנה לשימוש על ידי בתי ספר, חברות סביבתיות, כמו גם גופים אחרים הפועלים במימון קטן. בעתיד, בשיטה זו ניתן להשתמש בהגדרה מאוד מתוחכמת כדי לחקור תופעות בזמן אמת על התנועה וmechanosensation של מינים מיקרוסקופיים. שיטה זו הופכת את מחקרי אורך גל יחיד במגוון רחב של זוויות ועומקי צפייה זמינים בקלות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה על התמיכה ואסאר מכללה לתואר ראשון מחקר מכון הקיץ (ursi), קרן המחקר לסלמון לוסי מיינארד, הפרס נאס"א מס NX09AU90A, המרכז הלאומי למדע קרן למצוינות מחקר במדע והטכנולוגיה (NSF-CREST) מס 'הפרס 0630388 ומס 'הפרס NSF 1,058,385.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm	Thorlabs	LA1257

References

Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).
Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
Keller, H. E., Pawley, J. B. . Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. , (2011).
Demtröder, W. . Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).
Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).
Mood, A., Graybill, F., Boes, D. . Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).
Taylor, J. R. . Classical Mechanics. , (2005).
Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
Bevington, P. R. . Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).
Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).
Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O’Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

Automatically Generated