Kolorimetrik Algılama Paper-based<em> Escherichia coli</em><em> Salmonella</em> Spp. Ve<em> Listeria monocytogenes</em> Tarım Su geniş hacimli
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Bu protokol, tarımsal sularının büyük hacimli Escherichia coli, Salmonella spp. Ve Listeria monocytogenes hızlı kolorimetrik tespitini (10 L) da açıklamaktadır. Burada su bakteri konsantre, plastik bir kartuş içine basit bir ağ filtre oluşur steril Modifiye Moore Swabs (MMS), süzülür. Süzüldükten sonra, hedef bakteriler için seçici olmayan ya da seçici bir zenginleşme MMS gerçekleştirilir. Hedef bakteri kolorimetrik tespiti için, zenginleşmesi sonra bakteri işaret eden alt-tabakalar ile gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPADs) kullanılarak deneye tabi tutulur. Her bir alt-tabaka üzerinde görsel μPAD (kalitatif tespiti) tespit edilebilir renkli ürünler üreten, hedef gösterge bakteryel enzimler ile reaksiyona girer. Alternatif olarak, reaksiyona μPADs dijital görüntüler ortak tarama ve çekim cihazları ile ve oluşturulan ImageJ yazılımı al kullanılarak analiz edilebilirsonuçlar daha objektif ve standart yorumlanması için lowing. Biyokimyasal tarama işlemleri yukarıda bahsedilen bakteriyel patojenler belirlemek için tasarlanmış olsa da, enzimler, arka mikrobiyota veya kolorimetrik alt-tabakaların bozulması tarafından üretilen bazı durumlarda yanlış pozitif üretebilir. Bu nedenle, daha ayrımcı teşhis kullanılarak teyit gereklidir. Bununla birlikte, bu bakteriyel konsantrasyon ve algılama platformu bir ilk tarama yöntemi olarak kullanılmasını haklı, (konsantrasyon, zenginleştirme ve algılama yaklaşık 24 saat içinde yapılır), ucuz (0,1 CFU / ml tespit sınırı) duyarlı, gerçekleştirmek kolay ve hızlıdır Tarımsal su mikrobiyolojik kalitesi için.
Introduction
Bu gıda kaynaklı hastalık etmenleri gıda kaynaklı hastalık yükünü azaltmak için alan bazlı ortamlarda hızla ve tercihen tespit edilmesi önemlidir. Gıda kaynaklı bakteriyel patojenler tespit etmek için ortak stratejiler biyokimyasal profil, seçici ve diferansiyel kültürlemenin, immünolojik izolasyon ve algılama ve moleküler algılama vardır. Ancak, bu yöntemler sporadik kirlenme tarafından engellendiğini, test küçük bir örnek boyutları, gıda kaynaklı patojen bakterilerin genellikle düşük konsantrasyonlarda, uzun işlem süreleri gerektiren ve / veya alan ayarları için geçerli değildir. Bundan başka, birçok gıda matrislerdeki bileşiklerin tespit ve teşhis uygulamalarına önleyici bulunmaktadır. Mikrobiyal algılama olasılığını artırmak amacıyla, Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (örneğin, yıkama, su ve sulama suyu olarak) Tarımsal su testi taze ürün büyük bir yüzey alanı ile temas ya da bir araç olarak hizmet eder ya da bu da önerdi produce kontaminasyon gıda 1. doğrudan test için bir alternatiftir. Buna rağmen, temsili tarımsal su numunesi seyreltme etkisi ile birleştiğinde genellikle düşük, doğal patojen-patojen yükü konsantrasyon için numune hazırlama yöntemleri gerekli kılar. Bu tür bir yöntem, su (≥ 10 L), uygun patojen-konsantrasyonu ve alt algılama stratejileri ile uyumluluk geniş hacimli örnekleme gerektirir.
Modifiye Moore bezlerden (MMS) su 2-4 büyük hacimlerde (≥ 10 L) bakterileri konsantre için kullanılan, ucuz, basit ve sağlam cihazlardır. MMS bir peristaltik pompa kullanılarak pompalanmıştır kaset su büyük miktarlar için, bir kaba filtre olarak hizmet gazlı bez, dolu bir plastik kaset oluşur. MMS işlenmiş li mikroorganizmalar da dahil olmak üzere organik ve inorganik tanecikli madde yakalar bakteri konsantrasyonu (≥ 10 kat konsantrasyon) bir ayrım yöntemisterlin örnekleri. Bu, MMS ile hedef mikroorganizma konsantrasyonunun mükemmel etkinliği mikroorganizmalar silt-kil fraksiyonu ya da süspanse edilmiş katı maddelerin 3 organik mikro agrega bağlı olması beklenmektedir gerçeği ile açıklanabilir olasıdır. MMS sağlam tasarımı, bu tür filtrelerin tıkanması, büyük hacimli işleme yetersizlik, yüksek bulanıklık ile filtre örnekleri ve yüksek maliyetler gibi sudan bakteri, yakalanması ve konsantrasyon için diğer filtrasyon yöntemleri ile ilgili en eksikliklerin sağlar. Bu nedenlerle, FDA MMS çevre ve üretmek, ilgili numune toplama prosedürleri 5 resmi işlemleri dahil edilmesi tavsiye edilmektedir.
Burada, bir yöntem olup, konsantrasyon, zenginleştirme ve Escherichia coli algılama, Salmonella spp. Ve tarımsal sularından Listeria monocytogenes için açıklanmıştır. A MMS Bact konsantrasyonu için kullanılıreria ve ayrıca seçici ya da seçici olmayan bakteriyel zenginleştirilmesi için bir kap olarak işlev görür. Bakteriyel algılama kağıt tabanlı analitik cihazları (μPADs) 6 kullanılarak biyokimyasal elde edilir. μPADs akışkan ağları veya Fotolitografi, inkjet baskı, damgalama, ve balmumu 7-11 baskı da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak nokta testleri olarak imal edilebilir. Akışkan tasarımları örnekleri, numunenin merkez yatırılır ve daha sonra, numune ya da alt-tabaka merkezine 12 içine kılcal hareket ile kanalın dış rezervuar çekilir edildiği distal rezervuar ya da tek kanal alışkanlıklarına akar dendritik kanal desen olabilir. Bu protokol için, biz burada test mikroorganizmaların göstergesidir enzimler tarafından işlenebilir kromojenik substratları ile ankastre 7 mm çaplı balmumu kağıt nokta diziler için istihdam seçtiniz: Klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) ve 5 – bromo-4-kloro-3-indolil β-D-glukuronid (X-Gluc)E. tarafından üretilen β-galaktosidaz ve β-glukuronidaz saptanmasında coli; Salmonella spp tarafından üretilen, C8-esteraz tespiti için 5-bromo-6-kloro-3-indolil kaprilat (kırmızı kaprilat).; fosfatidilinositol özgü fosfolipaz C tespiti için ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-miyo-inositol fosfat (X-InP) (PI-PLC) tarafından üretilen L. 6 monocytogenes. Bu nedenle, belirli bir bakteri varlığı, karmaşık ekipman ve veri yorumlama için gerek kalmadan görsel olarak gözlenebilir. Bu özel hedef bakterilerin enzim bazlı kolorimetrik μPAD algılama spesifikliği ve duyarlılığı, daha önce 6 incelenmiştir. Buna ek olarak, bu hedef bakteriler için entegre konsantrasyon algılama yönteminin hassasiyeti mikroorganizmalar (yayınlanmamış veriler ve Bisha et al. 13) önceden belirlenmiş bir seviyede suyun büyük hacimlerde spike ile değerlendirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, E. saptanması için entegre bir yöntem tarif E. coli, Salmonella spp. ve L. Tarımsal suda monocytogenes. Burada, tarım büyük hacimlerde suyun bakterilerin MMS konsantrasyonu (10 L), bakteriyel zenginleştirme ile birleştiğinde ve bakteri gösterge kolorimetrik tespiti μPADs kullanıyor. Bakteriler 10 kat konsantre olurken MMS prosedürü su örneklerinde yüksek partikül içeriği ile başa çıkabilir, sağlam ve az eğitimli personel tarafından saha uygulamal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
