מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em> חיידקי Escherichia</em>,<em> סלמונלה</em> Spp., ו<em> חיידקי ליסטריה</em> מכמויות גדולות של מים לחקלאות
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר זיהוי מהיר של חיידקי colorimetric Escherichia coli, סלמונלה spp., ויסטריה מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות. כאן, מים מסוננים דרך הטושים השתנה סטרילי מור (MMS), שמורכבים ממסנן גזה פשוט סגור במחסנית פלסטיק, להתרכז חיידקים. לאחר סינון, מוספים להלא סלקטיבי או סלקטיבי לחיידקי היעד מבוצעים ב- MMS. לגילוי colorimetric של חיידקי היעד, ההעשרה מכן assayed באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) משובצים עם מצעי חיידקים אינדיקטיביים. כל מצע מגיב עם אנזימים חיידקיים היעד מעיד, שהניבו מוצרים צבעוניים שיכול להיות מזוהה מבחינה ויזואלית (זיהוי איכותי) בμPAD. לחלופין, תמונות דיגיטליות של μPADs הגיב יכולות להיות שנוצרו עם סריקה משותפת או מכשירי צילום ונותחו באמצעות תוכנת ImageJ, אלגעייה לפרשנות אובייקטיבית וסטנדרטית יותר של תוצאות. למרות נהלי ההקרנה ביוכימית נועדו לזהות את החיידקים פתוגנים האמור, במקרים מסוימים המיוצרים על ידי אנזימי חיידקי רקע או השפלה של מצעי colorimetric עשוי לייצר חיובי כוזב. לכן, יש צורך באישור שימוש מפלה יותר לאבחון. יחד עם זאת, פלטפורמת ריכוז וזיהוי חיידקים זה היא זול, רגיש (0.1 CFU / גבול גילוי מיליליטר), קלה לביצוע, ומהירה (ריכוז, העשרה, וזיהוי מבוצעים בתוך כ 24hr), מצדיקים את השימוש בו כשיטת סינון ראשונית לאיכות המיקרוביאלית של מים לחקלאות.
Introduction
חשוב שסוכני מחלה במזון מזוהים במהירות ורצוי בהגדרות המבוסס על שדה במטרה להפחית את הנטל של מחלה במזון. אסטרטגיות נפוצות כדי לזהות חיידקים פתוגנים במזון כוללות אפיון ביוכימי, culturing סלקטיבית והפרש, בידוד וזיהוי של מערכת חיסון, וזיהוי מולקולרי. עם זאת, שיטות אלה הקשו על ידי זיהום סדיר, גודל מדגם קטן נבדק, הריכוזים נמוכים לעתים קרובות של החיידקים פתוגניים במזון, דורשים זמני עיבוד ארוכים, ו / או אינם ישימים להגדרות שדה. יתר על כן, תרכובות במטריצות מזון רבות מוגבלים לזיהוי ואבחון יישומים. על מנת לשפר את הסיכוי לגילוי חיידקים, ארצות הברית מנהל המזון והתרופות אמריקניות הציעו כי בדיקות מים לחקלאות (כגון מים מים לשטוף והשקיה) אשר גם באה במגע עם שטח פנים גדול של תוצרת טרייה או משמשת ככלי עבור pזיהום roduce הוא חלופה לבדיקה ישירה של מזון 1. למרות זאת, הפתוגן-הנטל הטבעי לעתים קרובות הנמוך בשילוב עם אפקט הדילול של דגימת מים החקלאית הנציג עושה שיטות הכנת מדגם לריכוז הפתוגן חיוניות. שיטה כזו תדרוש דגימה בכמויות גדולות של מים (≥ 10 L), פתוגן ריכוז נאות, ותאימות עם אסטרטגיות זיהוי במורד הזרם.
מטליות הותאמו מור (MMS) הם מכשירים זולים, פשוט, ומחוספסים המשמשים לריכוז חיידקים מכמויות גדולות (≥ 10 L) של המים 2-4. MMS מורכב מקלטת פלסטיק מלאה עם גזה, המשמשת כמסנן גס לכמויות גדולות של מים נשאבות באמצעות הקלטת באמצעות משאבת peristaltic. MMS הוא שיטה בלתי מפלה של ריכוז חיידקים (≥ ריכוז 10 פי) הלוכדת חלקיקי חומר אורגני ולא אורגני, כולל מיקרואורגניזמים בli מעובדדגימות פאונד. סביר להניח כי את היעילות מצוינת של ריכוז של מיקרואורגניזמים המטרה על ידי MMS יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה כי מיקרואורגניזמים צפויים להיות מחובר לשבריר סחף החימר או מיקרו אגרגטים האורגניים של המוצקים מרחפים 3. העיצוב המחוספס של MMS מאפשר להתגבר על מרבית הליקויים הקשורים לשיטות סינון אחרות עבור לכידה וריכוז של חיידקים ממים, כגון סתימה של מסננים, חוסר יכולת לעבד כמויות גדולות, דגימות עם מסנן גבוה עכירות, ועלויות גבוהות. מסיבות אלה, ה-FDA ממליצה שMMS של ישולב נהלים רשמיים לנהלי איסוף דגימה סביבתיים וקשורות לייצר 5.
הנה, שיטה מתוארת לריכוז, להעשרה, וזיהוי של Escherichia coli, סלמונלה spp., וחיידקים ליסטריה ממים חקלאיים. MMS משמש לריכוז של bacteria, ומשמש גם ככלי להעשרת חיידקים סלקטיבית או לא סלקטיבית. גילוי חיידקים מושגת ביוכימית באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) 6. יכול להיות מיוצר μPADs כרשתות fluidic או בדיקות מקום באמצעות מגוון של שיטות, כולל photolithography, הדפסת דיו, הטבעה, ושעוות הדפסת 7-11. דוגמאות של עיצובי fluidic יכולות להיות דפוסי ערוץ הדנדריטים בי המדגם מופקד במרכז ובהמשך זורם למאגרי דיסטלי או דפוסי ערוץ אחד שבו המדגם או המצע הם משכו מהמאגרים החיצוניים של הערוץ על ידי פעולת נימים למרכז 12. עבור פרוטוקול זה, בחרנו להעסיק למערכי 7 מ"מ בקוטר נייר שעוות מקום שנעוצים עם מצעי chromogenic שיכול להיות מעובד על ידי אנזימים מעידים על מיקרואורגניזמים נבדקו כאן: β-D-galactopyranoside האדום Chlorophenol (CPRG) ו 5 – bromo-4-כלורו-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)לצורך זיהוי של β-galactosidase וβ-glucuronidase הופק על ידי א coli; caprylate 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl (caprylate מגנטה) לצורך זיהוי של C8-esterase מיוצר על ידי spp סלמונלה.; ופוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-מיו-אינוסיטול (X-InP) לצורך זיהוי של C פוספוליפאז phosphatidylinositol הספציפי (PI-PLC) המיוצר על ידי ל ' חיידקי 6. לפיכך, נוכחותו של חיידק מסוים ניתן להבחין באופן חזותי ללא הצורך בציוד מורכב או נתונים לפרשנות. הסגוליות והרגישות של זיהוי μPAD colorimetric מבוסס אנזים של חיידקי היעד הספציפיים אלה כבר נחקרו בעבר 6. בנוסף, הרגישות של שיטת ריכוז איתור המשולבת עבור חיידקי היעד אלה הוערכה על ידי יוצרות עלייה חדה של כמויות גדולות של מים עם רמות שנקבעו מראש של מיקרואורגניזמים (נתונים שלא פורסם וBisha et al. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה משולבת לאיתור E. coli, סלמונלה spp., ול ' חיידקי במים לחקלאות. כאן, ריכוז MMS של חיידקים מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות, בשילוב עם העשרה בקטריאלי, וזיהוי colorimetric חיידקים-מעידים באמצעות μPADs. הליך MMS יכול להתמודד עם תוכן גבוה חלקיקים בדגימות ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
