Summary

Colorimétrico Papel a base de Detección de<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp,. Y<em> Listeria monocytogenes</em> De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Published: June 09, 2014
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Summary

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

Este protocolo describe la detección colorimétrica rápida de Escherichia coli, Salmonella spp., Y Listeria monocytogenes a partir de grandes volúmenes (10 L) de aguas agrícolas. Aquí, el agua se filtra a través estéril modificados hisopos de Moore (MMS), que consisten en un filtro simple gasa encerrado en un cartucho de plástico, para concentrar bacterias. Después de la filtración, enriquecimientos no selectivos o selectivos para las bacterias diana se realizan en el MMS. Para la detección colorimétrica de las bacterias diana, los enriquecimientos después se ensayan utilizando dispositivos analíticos basados ​​en papel (μPADs) incrustados con sustratos bacterias indicativas. Cada sustrato reacciona con enzimas bacterianas-objetivo indicativo, la generación de productos coloreados que pueden detectarse visualmente (detección cualitativa) en el μPAD. Alternativamente, las imágenes digitales de los μPADs reaccionado se pueden generar con la exploración común o dispositivos fotográficos y se analizaron utilizando el software ImageJ, ALtes para la interpretación más objetiva y estandarizada de los resultados. Aunque los procedimientos de cribado bioquímico están diseñadas para identificar los patógenos bacterianos mencionados anteriormente, en algunos casos, las enzimas producidas por la microbiota fondo o la degradación de los sustratos colorimétricos puede producir un falso positivo. Por lo tanto, es necesaria una confirmación mediante un diagnóstico más discriminatorio. Sin embargo, esta concentración y detección de la plataforma bacteriana es barato, sensible (0,1 CFU límite de detección / ml), fácil de realizar, rápido y (concentración, enriquecimiento, y la detección se llevan a cabo dentro de aproximadamente 24 horas), justificando su uso como un método de cribado inicial de la calidad microbiológica del agua para la agricultura.

Introduction

Es importante que los agentes de enfermedades transmitidas por los alimentos se detectan rápidamente y preferentemente en entornos basados ​​en el terreno con el fin de reducir la carga de enfermedades transmitidas por los alimentos. Las estrategias comunes para detectar bacterias patógenas transmitidas por los alimentos incluyen perfiles bioquímicos, el cultivo selectivo y diferencial, aislamiento inmunológico y detección, y la detección molecular. Sin embargo, estos métodos se ven obstaculizados por la contaminación esporádica, los pequeños tamaños de las muestras analizadas, las concentraciones bajas a menudo de las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos, requieren largos tiempos de procesamiento, y / o no son aplicables para la configuración del campo. Además, los compuestos en muchas matrices de alimentos son inhibitorios para la detección y aplicaciones de diagnóstico. Con el fin de mejorar la probabilidad de detección microbiana, la Food and Drug Administration de los Estados Unidos ha sugerido que la prueba del agua agrícola (como el agua de lavado y el agua de riego) que, o bien entra en contacto con una gran superficie de los productos frescos o sirve como un vehículo para pcontaminación laborar es una alternativa viable a la prueba directa de alimentos 1. Aun así, la frecuencia baja de patógenos y carga física, junto con el efecto de dilución de la muestra representativa del agua agrícola hace que los métodos de preparación de muestras para la concentración de patógenos esencial. Tal un método requeriría el muestreo de grandes volúmenes de agua (≥ 10 L), adecuada concentración de patógenos, y la compatibilidad con las estrategias de detección aguas abajo.

Hisopos de Moore Modificados (MMS) son dispositivos baratos, sencillos y robustos utilizados para concentrar las bacterias de volúmenes grandes (≥ 10 L) de agua 2-4. El MMS se compone de un casete de plástico llena de gasa, que sirve como un filtro grueso para grandes volúmenes de agua bombeada a través de la cassette mediante una bomba peristáltica. El MMS es un método no discriminatorio de la concentración bacteriana (≥ concentración 10 veces) que captura material particulado orgánico e inorgánico que incluye microorganismos en li procesadomuestras de contrapartidas. Es probable que la excelente eficacia de la concentración de microorganismos diana por el MMS se puede explicar por el hecho de que se espera que los microorganismos que se adjunta a la fracción limo-arcilla o microagregados orgánicos de los sólidos en suspensión 3. El diseño resistente de la MMS permite la superación de la mayoría de los inconvenientes asociados con otros métodos de filtración para la captura y concentración de bacterias del agua, tales como la obstrucción de los filtros, la incapacidad para procesar grandes volúmenes, muestras de filtros con alta turbidez, y los altos costos. Por estas razones, la FDA recomienda que la MMS se incorporarán a los procedimientos oficiales para los procedimientos de recogida de muestras ambientales y relacionados con la producción de 5.

Aquí, se describe un método para la concentración, enriquecimiento, y la detección de Escherichia coli, Salmonella spp., Y Listeria monocytogenes de aguas agrícolas. Un MMS se utiliza para la concentración de bactEria, y también sirve como un recipiente para el enriquecimiento bacteriana selectiva o no selectiva. Detección bacteriana se logra bioquímicamente utilizando dispositivos analíticos basados ​​en papel (μPADs) 6. μPADs pueden ser fabricados como redes de fluidos o pruebas in situ utilizando una variedad de métodos que incluyen la fotolitografía, impresión de chorro de tinta, estampación, y cera de impresión 7-11. Ejemplos de diseños de fluidos pueden ser patrones de canal dendríticas en donde se deposita la muestra en el centro y, posteriormente, los flujos de depósitos distales o patrones de un solo canal en el que la muestra o sustrato se extraen de los depósitos externos de la canal por la acción capilar en el centro 12. Para este protocolo, hemos decidido emplear para 7 mm de diámetro de papel encerado arrays manchas incrustadas con sustratos cromogénicos que pueden ser procesados ​​por enzimas indicativas de los microorganismos ensayados aquí: clorofenol rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) y 5 – bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucurónido (X-Gluc)para la detección de β-galactosidasa y β-glucuronidasa producida por E. coli; Caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (caprilato magenta) para la detección de C8-esterasa producida por Salmonella spp.; y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-mio-inositol (X-InP) para la detección de específica de fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC) producida por L. monocytogenes 6. Por lo tanto, la presencia de una bacteria en particular puede observarse visualmente sin la necesidad de equipo complejo o interpretación de los datos. La especificidad y la sensibilidad de la detección colorimétrica μPAD a base de enzimas de estas bacterias diana específica se ha explorado previamente 6. Además, la sensibilidad del método de detección de la concentración integrada para estas bacterias diana se evaluó por spiking de grandes volúmenes de agua con niveles predeterminados de microorganismos (datos no publicados y Bisha et al. 13).

Protocol

1. Concentración de bacterias a partir de grandes volúmenes de agua en la agricultura mediante MMS Preparación MMS Cortar una sección rectangular de una gasa de 4 capas de medición de 40 x 12 cm. Doble la estopilla en ambos ejes para obtener un rectángulo de 20 x 6 cm. Rollo de la gasa firmemente a lo largo de su eje largo para formar un bastoncillo cilíndrico de aproximadamente 6 cm de altura y 3 cm de diámetro. Autoclave el hisopo una gasa en papel de aluminio,…

Representative Results

Tal como se describe en este protocolo, la concentración de bacterias utilizando los MMS (Figura 1) se puede realizar en un plazo aproximado de 15-20 min. Los MMS en construidas a partir de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) en dos componentes separados; una tapa y un cartucho de ambos con un conjunto de espiga integrado en el que se inserta un hisopo de gasa cilíndrica (Figura 1A). Ambos componentes se atornillan entre sí formando los MMS (Figura 1B). Procesamie…

Discussion

Este protocolo describe un método integrado para la detección de E. coli, Salmonella spp., y L. monocytogenes en agua para la agricultura. Aquí, la concentración de MMS de bacterias a partir de grandes volúmenes (10 L) de agua para la agricultura, se acopla con el enriquecimiento bacteriana, y la detección colorimétrica-bacteriana indicativa utilizando μPADs. El procedimiento de MMS puede hacer frente a un alto contenido de partículas en las muestras de agua, mientras que la concentración de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.

Materials

Agricultural water Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing Wilmar BN-CVT1005  1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge  Lumiere Diagnostics 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth Chesapeake Wiper & Supply, Inc. CC90 Grade #90, 44 × 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach Various Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate Mallinckrodt Baker Inc 8100-04
Manifold Built in-house Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump Micron Meters RPP1300 Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette Various Disposable, 10ml
Universal preenrichment broth Difco 223510
Buffered peptone water Difco 218105
Salmonella supplement Biomérieux Industry 42650 http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth Biomérieux Industry 410848 http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin Sigma-Aldrich 861987 http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid Various Drummond DP-110 used here
Shaking incubator Various Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette  Various 10 μl, 1 ml
Micropipette tips Various Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase- free
Probe sonicator Q Sonica LLC XL-2000 series
µPADs Avant  Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Sigma-Aldrich B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  Sigma-Aldrich 53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  Sigma-Aldrich 38896
Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm Various Sterile
Flat bed scanner Various Xerox USB scanner
ImageJ software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/

References

  1. . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
  4. McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
  5. . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
  6. Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
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  10. Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
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  12. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
  13. Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).

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Cite This Article
Bisha, B., Adkins, J. A., Jokerst, J. C., Chandler, J. C., Pérez-Méndez, A., Coleman, S. M., Sbodio, A. O., Suslow, T. V., Danyluk, M. D., Henry, C. S., Goodridge, L. D. Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water. J. Vis. Exp. (88), e51414, doi:10.3791/51414 (2014).

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