Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Os transtornos mentais e neurológicos representam 13% da carga global de doenças, novos desafios, como os mecanismos fisiopatológicos, fatores de risco e biomarcadores prodromal deve ser explorado ^1. Em linha com esse objetivo, proteômica estudos do cérebro humano tornou indispensável para descobrir vias moleculares envolvidas em processos como a memória, o comportamento, as emoções e plasticidade neuronal, por exemplo, não só para o fisiológico, mas também para condições patológicas. Portanto, a utilização de modelos animais e, mais especificamente, os ratinhos transgénicos, leva uma ampla gama de possibilidades para imitar a etiologia de desordens neurodegenerativas humanas ^2.

Abordagens proteômicas estão hoje disponíveis, a fim de realizar estas novas perspectivas no campo da neurociência. Electroforese em gel bidimensional (2DE) é um método simples e potente provável que permite comparar o proteoma de uma vasta gama de amostras. Além disso, é também umpoderoso método para isolar uma proteína a partir de uma mistura complexa, a fim de identificar e analisar mais por espectrometria de massa. Esta técnica consiste, essencialmente, em duas etapas sucessivas: 1) a separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pi) por isoelectrofocusing (IEF). Mais precisamente, um potencial elétrico é aplicado através das tiras de acrilamida Immobiline entre um gradiente de pH e, em seguida, as proteínas irão migrar e se concentrar em um pI determinado em função de sua carga líquida global. 2) proteínas Isoelectrically focadas são desnaturados e negativamente carregados pela adição de dodecilsulfato de sódio (SDS), desse modo as proteínas na sua primeira estrutura são separadas de acordo com o seu peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE ^3. Estas duas propriedades distintas nos permitem enfrentar um duplo valor para ir mais longe no estudo do proteoma. Por um lado, esta abordagem oferece a possibilidade de realizar uma análise quantitativa utilizando corantes mínimas método 2D-DIGE, e por outro lado um qualitativanálise e por mini-2DE acoplada a transferência de western.

A análise quantitativa por 2D-DIGE concede a expressão da proteína muda todo o proteoma amostra. Resumidamente, as amostras são rotulados com três cianinas (Cy2, Cy3 e Cy5) emitindo em três comprimentos de onda diferentes (azul, verde e vermelho). Estes corantes fluor mínimo contendo grupo de éster N-hidroxi succinimidil reagir com o grupo ε-amino de lisinas de resíduos de proteínas, resultando em ligações covalentes amida ^4. Resíduos de lisina são rotulados apenas entre 1-3% e evitando assim várias etiquetas por adição de proteína e grandes modificações carga líquida ^{5, 6.} Cy3 e Cy5 são muitas vezes utilizados para rotular duas amostras independentes, enquanto Cy2 Tag uma mistura de igual proporção das amostras para comparar. As duas principais vantagens são de que todas as amostras marcadas são misturadas e IEF e SDS-PAGE são realizadas em um gel de uma só vez para cada passo, evitando inter variabilidade entre experiências, devido à géis de comparação. Além disso, apresenta-se um limiar de detecção de pico de cerca de 1 femtomole de proteína ^7. Géis são digitalizados e software 2D compara as imagens de fluorescência de gel 2D, onde Cy2 serve como padrão interno permitindo a identificação de diferenças estatísticas entre os pontos para a sua posterior identificação por espectrometria de massa. O software de análise de 2D utilizando o padrão interno atinge uma rápida detecção de menos do que 10% das diferenças entre as amostras com mais de 95% de confiança estatística ^8.

A análise qualitativa por mini-2DE é um passo crucial para a caracterização de proteínas. O princípio é o mesmo que anteriormente descrito para a separação de pI e PM, mas, neste caso, as proteínas são transferidas a partir de um pequeno gel de poliacrilamida para uma membrana e imunotransferência é executada posteriormente. Enquanto uma dimensão de electroforese em gel proporciona as alterações na expressão de proteína por um ou vários epitopos da proteína em função do anticorpo, o INFORMAÇÃOn de mini-2DE dota com dois parâmetros adicionais. Em primeiro lugar, os isovariants proteína mudar em função do pI, indicando que as modificações pós-traducionais pode ter lugar. Em segundo lugar, a identificação de espectrometria de massa pode ser um indicativo de zimogénios plausíveis e produtos do catabolismo de proteínas. Portanto, as modificações observadas por 2D-DIGE provavelmente indicativo dos mecanismos de mudanças no perfil global proteoma subjacentes. Alinhamentos de immunoblots entre várias amostras para o mesmo epítopo de proteína / s por mini-2DE podem refletir mudanças de acidez derramando luz em variações pós-traducionais pouco observados ou até mesmo não por immunoblotting monodimensional ^{9, 10.} Além disso, esta análise informa sobre os potenciais locais de clivagem, devido ao conhecimento do pI e PM dos resíduos metabólicos ^11,12.

A combinação destas duas técnicas proporciona uma análise proteômica complementar. Por um lado 2D DIGE oferece um tipe das diferenças, permitindo um isolamento precisa de polipéptidos, cuja expressão é diferente. Essas diferenças consistem essencialmente no aparecimento ou desaparecimento de uma mancha ou aumento / diminuição da intensidade de um dado, uma a análise dos géis fluorescentes software. No entanto, estas observações são, por si só não consegue explicar a natureza da modificação observada. Por estas razões, uma vez que o polipéptido é isolado e identificado por espectrometria de massa, a utilização de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) A identidade da proteína isolada e 2) a natureza da diferença: a mudança no nível isovariant / isoforma expressão, modificações pós-traducionais e os processos de clivagem, por exemplo. No entanto, é necessário o desenvolvimento de um tampão de lise a partir tanto compatíveis com o 2D-DIGE e com mini-2DE, a fim de limitar as dispersões potenciais resultantes da utilização de protocolos de extracção que são muito diferentes.

No presente artigo, desdescrito um protocolo adaptado para a preparação, extracção e desempenho de 2D-DIGE e técnicas de mini-2DE de proteínas cerebrais provenientes de tecido humano e de rato.