Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Zihinsel ve nörolojik bozukluklar hastalık küresel yükünün% 13 temsil eden, patofizyolojik mekanizmaları, risk faktörleri ve prodromal biyomarkerler gibi yeni sorunlar ¹ araştırılmalıdır. Bu amaç doğrultusunda, insan beyninin proteomiks çalışmalar fizyolojik hem de patolojik koşulları için değil, sadece hafıza, davranış, duygu ve örneğin nöronal plastisite gibi süreçlerde moleküler yolları ortaya çıkarmak için vazgeçilmez hale. Bu nedenle, hayvan modellerinin kullanımı ve daha özel olarak ise transgenik fareler, insan nörodejeneratif hastalıkların ² etyolojisini taklit etmek mümkün olan geniş bir yelpazede getiriyor.

Proteomiks yaklaşımlar nörobilim alanında bu yeni perspektifler başarmak için günümüzde mevcuttur. İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) Numunelerin geniş bir proteomesini karşılaştırma sağlayan bir kuvvetli ve muhtemelen basit bir yöntemdir. Ayrıca, aynı zamanda birbelirlemek amacıyla kompleks bir karışımdan bir proteini izole etmek ve ayrıca kütle spektrometresi ile analiz etmek için güçlü bir yöntem. (IEF) ile isoelectrofocusing izoelektrik noktası (pl) 'ye göre 1) protein ayırma: Bu teknik, esas olarak birbirini takip eden iki adımda oluşur. Daha özel olarak, bir elektrik potansiyeli arasındaki bir pH gradyanı Immobiline akrilamid şeritler arasında uygulanır ve daha sonra proteinler göç ve küresel net yük fonksiyonu olarak belirli bir pl odaklanacaktır. 2) Isoelectrically odaklı proteinler ilk yapısında, böylece proteinler SDS-PAGE ile ³ bunların görünür molekül ağırlığı (MW) bağlı olarak ayrılmış) denatüre edilmiş ve negatif sodyum dodesil sülfat (SDS ilavesiyle ücret. Bu iki farklı özellikler bize proteomun çalışmada daha ileri gitmek için bir çift değer mücadele verir. Bir yandan bu yaklaşım, minimal boyalar 2D-DIGE yöntemi kullanılarak, kantitatif analiz için imkanı sunar, ve diğer taraftan bir Nitelmini 2DE e analiz western blot bağlanmıştır.

2D-Dige ile kantitatif analiz protein ekspresyon tüm numune proteomun geçer bahşetmiştir. Kısaca, numuneler üç farklı dalga boylarında (mavi, yeşil ve kırmızı) de yayan üç siyaninler (Cy2, Cy3 ve Cy5) ile etiketli. N-hidroksi succinimidyl ester grubu içeren en az bir flor Bu boyalar, kovalent amid bağları ⁴ sonuçlanan protein lizinlerinin kalıntılarının ε-amino grubu ile reaksiyona girer. Lizin kalıntıları sadece% 1-3 arasında ve böylece protein başına birden fazla etiket ekleme ve büyük net ücret değişikliklerini ^{5, 6} önlenmesi etiketli. Cy3 ve Cy5 genellikle Cy2 karşılaştırma örneklerinin eşit oranda bir karışımı etiketler ise iki bağımsız örnekleri etiketlemek için kullanılır. İki ana avantajları, İşaretlenmiş örnekler karıştırılır ve IEF-PAGE ve SDS karşılaştırma jeller dolayı deneyler arasında en arası değişkenliği kaçınarak, her bir aşama için bir kerede bir jel içinde gerçekleştirilmektedir vardır. Ayrıca, protein ⁷ çevresinde 1 femtomole yüksek bir algılama eşiğini gösterir. Jeller taranır ve 2D yazılım Cy2, kütle spektrometrisi ile posterior tanımlanması için noktalar arasında istatistiksel farklılıklar tanımlamaya olanak sağlayan bir iç standart olarak hizmet 2B jel floresan görüntü karşılaştırır edilir. Dahili standart kullanarak 2B analiz yazılımı istatistiksel güvenliği ⁸ fazla% 95 örneği arasında fark% 10'dan daha az hızlı bir algılama sağlar.

Mini 2DE nitel analizi, protein karakterizasyonu için çok önemli bir adımdır. Prensibi daha önce pl ve MW ayrılması için anlatılan ile aynı olmakla birlikte, bu durumda, proteinlerin bir membran için küçük bir poliakrilamid jelinden aktarılır ve immunoblotting daha sonra gerçekleştirilir. Bir boyut jel elektroforezi bir ya da antikorun fonksiyonu informatio çeşitli protein epitoplar için protein ifadesindeki değişiklikler sağlarkenmini 2DE n iki ek parametreleri ile endows. İlk olarak, protein isovariants post-translasyonel modifikasyonlar yer alabilir belirten pl fonksiyonu olarak değişir. İkincisi, kütle spektrometresi kimlik makul zimogen ve proteinlerin katabolik ürünleri göstergesi olabilir. Bu nedenle, 2-dige ile gözlemlenen değişiklikler küresel proteom profilinde bir değişiklik altında yatan mekanizmaların gösterge muhtemeldir. Mini 2DE ile aynı proteini epitopiarı / s için çeşitli örnekler arasında İmmünoblotların Hizalanmalar asitliği az görülmüştür post-translasyon değişimleri içine ışık tutan bir değişiklik ya da değil monodimensional imünoblotlarını ^{9, 10} ile yansıtabilir. Ayrıca bu analiz metabolik kalıntılarının ^11,12 pl ve MW bilgisi nedeniyle potansiyel yarılma bölgeleri hakkında bilgi verir.

Bu iki tekniğin kombinasyonu tamamlayıcı proteomiks analizini sağlar. Bir yandan, bir 2D-DIGE tipik değer elde edilirifade farklı polipeptidleri, tam bir izolasyon sağlar farklılıklar e. Bu farklılıklar, bir nokta ya da floresan jellerin analiz yazılımı, belirli bir tek yoğunluğunun artış / azalış görünümünü kayboluşu ya da esas olarak oluşur. Bununla birlikte, tek başlarına bu gözlemler gözlenen değişiklik doğasını açıklamak için olası değildir. En isovariant / izoformu seviyesindeki değişiklik: polipeptid izole edilmiş ve kütle spektrometresi ile tanımlanır kez Bu nedenlerle, mini 2DE kullanılmasıdır) tam olarak 1 onaylamak için izole proteinin kimliğini ve farkın 2) doğasını sağlar Örneğin ekspresyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve bölünme işlemleri. Ancak, çok farklı olan ekstraksiyon protokollerin kullanımından kaynaklanan potansiyel dispersiyonlar sınırlamak amacıyla 2D-dige ve mini 2DE uyumlu hem de bir başlangıç ​​lizis tamponu geliştirmek için gereklidir.

Bu yazıda, biz de2D-dige ve insan ve fare beyin dokusundan gelen proteinler için mini 2DE tekniklerinin hazırlanması, ekstre etme ve performans için uyarlanmış bir protokol açıklandığı.