Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Psychische und neurologische Störungen repräsentieren 13% der globalen Krankheitslast, müssen neue Herausforderungen wie die pathophysiologischen Mechanismen, Risikofaktoren und Biomarker erforscht prodromal ¹ werden. Im Einklang mit diesem Ziel, Proteomik-Studien des menschlichen Gehirns unverzichtbar geworden, um molekulare Signalwege in Prozesse wie Gedächtnis, Verhalten, Emotionen und neuronale Plastizität zum Beispiel, nicht nur für die physiologische, sondern auch für pathologische Zustände beteiligt aufzudecken. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere die transgenen Mäuse, bringt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Entstehung von menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen ² nachzuahmen.

Proteomics Ansätze sind, um diese neue Perspektiven im Bereich der Neurowissenschaften zu erreichen heutzutage. Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein potenter und wahrscheinlich einfache Methode, um das Proteom von einer Vielzahl von Proben vergleichen können. Darüber hinaus ist es auch eineleistungsfähige Methode, um ein Protein aus einem komplexen Gemisch, um zu identifizieren und zu isolieren, weiter zu analysieren, durch Massenspektrometrie. Diese Technik besteht im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen: 1) Proteintrennung nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) von Isoelektrofokussierung (IEF). Genauer gesagt, wird ein elektrisches Potential über die Immobilin Acrylamid Streifen unter einem pH-Gradienten aufgetragen und dann Proteine ​​wandern und sich auf einen bestimmten pI in Abhängigkeit von ihrer globalen Nettoladung. 2) isoelektrisch fokussiert Proteine ​​denaturiert und negativ durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS geladen), wodurch Proteine ​​in ihrer ersten Struktur werden je nach ihrem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von SDS-PAGE ³ getrennt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichen es uns, einen double-Wert, weiter in der Studie des Proteoms gehen zu bewältigen. Auf der einen Seite dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit minimalen Farbstoffe 2D-DIGE-Verfahren durchzuführen, und auf der anderen Seite ein qualitaive Analyse von Mini-2DE zu Western-Blot gekoppelt.

Quantitative Analyse von 2D-DIGE verleiht Protein-Expression ändert sich über die Probe Proteom. Kurz gesagt werden Proben mit drei Cyanine (Cy2, Cy3 und Cy5) Emission bei drei verschiedenen Wellenlängen (blau, grün und rot) markiert. Diese Fluor minimal Farbstoffe N-Hydroxy Succinimidylester-Gruppe enthaltenden reagieren mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste von Proteinen, was zu kovalenter Amid-Bindungen ^4. Lysinreste werden nur zwischen 1-3% und damit verhindert, dass mehrere Etiketten zusätzlich pro Protein und die wichtigsten Änderungen der Nettoladung ^{5, 6} gekennzeichnet. Cy3 und Cy5 werden oft verwendet, um zwei unabhängige Stichproben zu kennzeichnen, während Cy2 Tags eine Mischung aus gleichen Teilen der Proben zu vergleichen. Die beiden wichtigsten Vorteile sind, dass alle markierten Proben werden gemischt und IEF und SDS-PAGE sind in ein Gel auf einmal für jeden Schritt durchgeführt, die Vermeidung der inter Variabilität unter Experimente durch Vergleich geliert. Darüber hinaus stellt es eine hohe Detektionsschwelle von rund 1 Femtomol von Protein ^7. Gele werden gescannt und 2D-Software vergleicht die 2D-Gel-Fluoreszenzbilder, wo Cy2 dient als interner Standard, die eine Identifizierung der statistischen Unterschiede zwischen den Stellen für ihren hinteren Identifizierung durch Massenspektrometrie. Das 2D-Analyse-Software mit dem internen Standard erreicht eine schnelle Erkennung von weniger als 10% der Unterschiede zwischen den Proben mit mehr als 95% der statistischen Vertrauens ^8.

Qualitative Analyse von Mini-2DE ist ein entscheidender Schritt für die Proteincharakterisierung. Das Prinzip ist das gleiche, wie zuvor für PI-und MW-Trennung beschrieben, aber in diesem Fall Proteine ​​werden von einer kleinen Polyacrylamid-Gel auf eine Membran übertragen und Immunoblot wird danach durchgeführt. Während einer Dimension Gelelektrophorese stellt Veränderungen in der Proteinexpression für ein oder mehrere Protein-Epitope in Funktion des Antikörpers, der INFORMATIOn von Mini-2DE verleiht mit zwei zusätzlichen Parametern. Erstens ändern die Protein isovariants in Abhängigkeit von der pI, die anzeigt, dass post-translationale Modifikationen stattfinden könnten. Zweitens kann die Massenspektrometrie Identifizierung bezeichnend für plausibel Zymogene und Abbauprodukte von Proteinen sein. Daher sind durch 2D-DIGE beobachtet Modifikationen wahrscheinlich ein Indikator für die zugrunde liegenden Mechanismen Veränderungen in der globalen Proteom-Profil. Alignments von Immunoblots unter mehreren Proben für das gleiche Protein-Epitop / s Mini-2DE kann Säure Veränderungen beleuchten in post-translationale Variationen etwas beobachtet oder gar nicht von eindimensionalen Immunoblotting ^{9, 10} reflektieren. Darüber hinaus informiert diese Analyse über die möglichen Spaltstellen aufgrund der Kenntnis des pI und MW der Stoffwechselrückstände ^11,12.

Die Kombination dieser beiden Techniken eine komplementäre Proteomik-Analyse. Auf der einen Seite 2D-DIGE bietet einen typ.e von Unterschieden ermöglicht eine präzise Trennung von Polypeptiden, deren Expression ist anders. Diese Unterschiede bestehen im wesentlichen in das Auftreten oder Verschwinden eines Flecks oder Zunahme / Abnahme der Intensität einer durch eine Software-Analyse der Fluoreszenz Gele. Jedoch sind diese Beobachtungen selbst kaum die Natur der beobachteten Änderung erklären. Aus diesen Gründen einmal das Polypeptid isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert, die Verwendung von Mini-2DE ermöglicht, genau zu bestätigen 1) die Identität des Proteins isoliert und 2) die Art der Unterschied: Änderung in der isovariant / Isoform Niveau Expression, posttranslationale Modifikationen und Spaltprozesse zum Beispiel. Jedoch ist es notwendig, einen Ausgangs Lysepuffer sowohl 2D-DIGE und mit Mini-2DE kompatibel sein, um die möglichen Dispersionen durch die Verwendung von Extraktionsprotokollen, die sehr unähnlich zu begrenzen entwickeln.

In dem vorliegenden Artikel werden wir debeschrieben eine angepasste Protokoll für die Vorbereitung, Extraktion und die Leistung der 2D-DIGE und Mini-2DE Techniken zur Gehirnproteine ​​aus humanen und Maus-Gewebe.