המוח פרוס Biotinylation:<em> Ex Vivo</em> גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים
Summary
סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.
Abstract
סחר endocytic מוסדר הוא המנגנון המרכזי המאפשר מגוון רחב של אירועי neuromodulatory, על ידי השליטה באופן דינמי קולט, ערוץ יון, והצגה פני תא טרנספורטר בזמן בקנה מידה דקות. יש מגוון רחב של מנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבונים בודדים. מחקרים חוקרים את הבסיס המולקולרי של סחר הסתמכו בעיקר על biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו שינויים בביטוי פני חלבון קרום בתגובה לגירויים אקסוגניים ומניפולציה גנטית. עם זאת, גישה זו הייתה מוגבלת בעיקר לתאים בתרבית, אשר לא יכול לשקף נאמנה את המנגנונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במשחק בנוירונים בוגרים. יתר על כן, גישות תאים בתרבית עשויות לזלזל הבדלי אזור ספציפי במנגנוני סחר בנשים. כאן, אנו מתארים את הגישה המרחיבה biotinylation פני תא להכנת פרוסה המוח החריף. אנחנולהוכיח כי שיטה זו מספקת גישה באיכות גבוהה למדידת שינויים מהירים ברמות פני חלבון קרום בנוירונים בוגרים. גישה זו עלולה להיות כלי רחב בתחום הסחר בendocytic העצבית.
Introduction
סחר endocytic הוא מנגנון סלולארי בכל מקום שמכוונן מצגת קרום הפלזמה של מגוון רחב של חלבוני קרום נפרד. אנדוציטוזה מספקת חומרים מזינים חיוניים לסביבה תאית 1 וdesensitizes איתות קולטן בתגובה לקולטן הפעלה 2. Endocytic מחזור חזרה לקרום הפלזמה יכולה בנוסף לשפר את האיתות תאית על ידי הגדלת רמות ביטוי חלבון על פני תא 3. יתר על כן, הפרעות סחר קרום הם מעורבים במספר רב של מחלות ומצבים פתולוגיים 4,5, והדגישו את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים בסחר endocytic חלבון. בעוד חלבונים רבים לנצל מנגנונים קלאסיים clathrin תלוי הפנמה, הרכבה ראיות בשנים האחרונות מוכיח כי מנגנוני endocytic clathrin עצמאי מרובים לשלוט בפוטנציאל endocytic של מערך הולך וגדל שלחלבונים 6,7. לכן, הצורך לחקור את מנגנוני endocytic הקלת סחר במערכות רלוונטיות פיסיולוגיות גדל במידה ניכרת.
במוח, סחר endocytic של קולטנים, תעלות יונים ומובילי הנוירוטרנסמיטר יש תפקיד עיקרי בהקמת פלסטיות הסינפטית 8-11 ותגובה לתרופות של התעללות 12-15, סופו של דבר משפיעות על רגישות עצבית ותגובות הסינפטי. עד כה רוב מחקרי סחר עצביים להסתמך על שני מערכות ביטוי Heterologous או נוירונים בתרבית ראשוניים, אף אחד מהם עשוי באופן מהימן משקפים מנגנונים במשחק בנוירונים בוגרים. כאן אנו מדווחים גישה המשתמשת biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו רמות חלבון פני השטח בפרוסות מוח חריפות הנגזרות ממכרסמים מבוגרים. שימוש בגישה זו, אנו מציגים נתונים שמראים כי טרנספורטר דופאמין striatal העכבר במהירות מפנים מחדשsponse ל-C phorbol תיווך אסתר החלבון kinase הפעלה (PKC).
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ידע רב שנים שסחר endocytic ביקורתי איתות הסינפטי משפיע במוח, זה הוכיח מאתגר למדוד כמותית שינויים בביטוי פני חלבון בתאי עצב בוגרים. בעבודה זו, אנו מדווחים גישה אמינה לתייג חלבון משטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. יש הכנות פרוסה מוח בעל היסטוריה ארוכה של שירות עבו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי DA15169 וDA035224 לHEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
