Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em> Ex Vivo</em> Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios
Summary
Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.
Abstract
Tráfico endocítico Regulamentado é o mecanismo central facilitar uma variedade de eventos neuromoduladores, controlando dinamicamente receptor, canal iônico, e transportador de apresentação da superfície celular em uma escala minutos tempo. Há uma grande diversidade de mecanismos que controlam o tráfico endocítica de proteínas individuais. Estudos que investigam as bases moleculares do tráfico têm dependido principalmente sobre biotinilaï superfície para medir quantitativamente mudanças na proteína da membrana expressão de superfície em resposta a estímulos exógenos e manipulação genética. No entanto, esta abordagem tem sido limitado principalmente para cultura de células, o que pode não refletir fielmente os mecanismos fisiologicamente relevantes em jogo em neurônios adultos. Além disso, as abordagens de células cultivadas podem subestimar as diferenças específicas da região em mecanismos de tráfico. Aqui, descrevemos uma abordagem que se estende biotinilaï superfície celular para a preparação fatia cerebral aguda. Nósdemonstrar que este método fornece uma abordagem de alta fidelidade para medir rápidas mudanças nos níveis de superfície de proteínas de membrana em neurônios adultos. Esta abordagem é provável que tenha ampla utilidade no domínio do tráfico de endocítico neuronal.
Introduction
Tráfico endocítico é um mecanismo celular ubíquo que ajusta a apresentação da membrana plasmática de uma variedade de proteínas de membrana integrais. Endocitose fornece nutrientes vitais para o ambiente intracelular e um dessensibiliza a sinalização do receptor em resposta à activação do receptor 2. Endocítica reciclagem de volta para a membrana plasmática pode adicionalmente melhorar a sinalização celular, aumentando os níveis de expressão de proteínas na superfície da célula 3. Além disso, as perturbações de tráfico de membrana estão implicados em inúmeras doenças e condições patológicas 4,5, salientando a necessidade de investigar os mecanismos moleculares que governam proteína tráfico endocítica. Embora muitas proteínas utilizar mecanismos de internalização clássicos dependente de clatrina, a evidência de montagem ao longo dos últimos anos demonstra que vários mecanismos de endocitose independente de clatrina governar o potencial endocítica de uma crescente variedade deproteínas de 6,7. Assim, a necessidade de investigar os mecanismos de endocitose que facilitam o tráfico de sistemas relevantes fisiológicas tem crescido consideravelmente.
No cérebro, o tráfico de endocitose de receptores, canais iônicos e transportadores de neurotransmissores tem um papel primordial no estabelecimento de plasticidade sináptica 8-11 e resposta a drogas de abuso 12-15, em última análise, que impactam a excitabilidade neuronal e respostas sinápticas. Até à data, a maioria dos estudos de tráfico neuronal dependem tanto sistemas de expressão heterólogos ou neurônios primários em cultura, nenhum dos quais pode refletir de forma confiável mecanismos em jogo em neurônios adultos. Aqui, apresentamos uma abordagem que usa biotinilaï superfície para medir quantitativamente os níveis da proteína de superfície em fatias cerebrais agudas derivadas de roedores adultos. Usando essa abordagem, apresentamos dados que demonstram que o mouse do transportador de dopamina no estriado internaliza rapidamente em reposta de forbol de éster mediada por proteína-quinase C (PKC) a activação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar do conhecimento de longa data que o tráfico endocítico criticamente impactos sinalização sináptica no cérebro, tem-se revelado difícil de medir quantitativamente mudanças na expressão da proteína de superfície em neurônios adultos. Neste trabalho, relatamos uma abordagem confiável para rotular proteína de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas. Preparações fatia do cérebro têm uma longa história de utilidade para registros eletrofisiológicos, que mantenham conexões sináptica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede DA15169 e DA035224 a HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
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