Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em> Ex Vivo</em> Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen
Summary
Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.
Abstract
Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.
Introduction
Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen, die Protein endozytischen Handel regieren zu untersuchen. Während viele Proteine nutzen klassische Clathrin-abhängigen Internalisierung Mechanismen, Anzeichen dafür in den vergangenen Jahren zeigt, dass mehrere Clathrin-unabhängige Mechanismen endozytischen regeln die endozytischen Potential einer wachsenden Palette vonProteine 6,7. So hat die Notwendigkeit, endozytischen Mechanismen für Menschenhandel in physiologisch relevanten Systemen zu untersuchen stark gewachsen.
Im Gehirn hat endozytischen Handel von Rezeptoren, Ionenkanäle und Neurotransmitter-Transporter eine primäre Rolle bei der Gründung der synaptischen Plastizität 8-11 und der Reaktion auf Drogen 12-15, letztlich Auswirkungen auf die neuronale Erregbarkeit und synaptischen Antworten. Bis heute hat die Mehrheit der neuronalen Handel Studien entweder heterologen Expressionssystemen oder kultivierten primären Nervenzellen verlassen können, von denen weder zuverlässig reflektieren Mechanismen eine Rolle spielen bei erwachsenen Neuronen. Hier ein Ansatz, der Biotinylierung Oberfläche verwendet, um quantitativ Oberflächenproteinspiegel in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Nagern abgeleitet messen berichten wir. Mit diesem Ansatz können Daten, die zeigen, dass die Maus striatale Dopamin-Transporter schnell verinnerlicht in re präsentieren wirReaktion auf Phorbolester-vermittelte Protein-Kinase C (PKC).
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfäh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
