La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

La producción de proteínas anticongelante (AFP) es un importante mecanismo de supervivencia de algunos organismos que viven en ambientes cargados de hielo. Hasta hace poco, se pensaba que la única función de las AFP era prevenir o retardar el crecimiento de cristales de hielo internos que bloquearían la circulación, causarían daño tisular y estrés osmótico. Los organismos que no pueden tolerar ningún grado de congelación, como los peces, expresan AFP para inhibir completamente el crecimiento de cristales de hielo¹. Otros, como la hierba, son tolerantes a la congelación y expresan AFP para inhibir la recristalización del hielo que reduce la formación de grandes cristales de hielo en sus tejidos^2. La estabilización de membranas a baja temperatura es otra función que se sugirió para las AFP^3. Recientemente, se sugirió un nuevo papel para la AFP de una bacteria antártica, Marinomonas primoryensis, de lagos salobres cubiertos de hielo⁴. Esta AFP es parte de una proteína adhesina⁵ mucho más grande que se cree que une la bacteria al hielo para un mejor acceso al oxígeno y los nutrientes⁶. Se sabe que otros microbios secretan AFP, lo que podría alterar la estructura del hielo en el que viven⁷.

Las AFP se han encontrado en algunos peces, insectos, plantas, algas, bacterias, diatomeas y hongos. Tienen secuencias y estructuras notablemente divergentes consistentes con su evolución de diferentes progenitores en varias ocasiones; y, sin embargo, todos ellos se unen al hielo e inhiben su crecimiento por el mecanismo adsorción-inhibición⁸. Cada una de las AFP tiene una superficie específica que actúa como su sitio de unión al hielo (SII). Estos han sido típicamente identificados por mutagénesis dirigida por el sitio de residuos superficiales^9-11. El IBS se presume para organizar las moléculas de agua en un patrón hielo-como que coincida con planos específicos del hielo. Así el AFP forma su ligand antes de atando a él^{5, 12}. Los planos de hielo se pueden definir por sus índices de Miller, y diferentes AFP pueden unirse a diferentes planos. Así, la AFP tipo I de la platija invernal se une a los planos piramidales^{20-21 13,}la AFP tipo III se une tanto al prisma primario como a los planos piramidales utilizando una superficie compuesta de unión al hielo^11,14,mientras que el gusano de abeto AFP, un AFP hiperactivo, se une simultáneamente tanto al plano primario como al basal^15,16. Otras AFP hiperactivas, como las AFP mp,se unen a múltiples planos de hielo como lo demuestra su cobertura completa de hemisferios de cristal de hielo individuales^5,17. Se presume, que la capacidad de las AFP hiperactivas para unirse al plano basal, así como a otros planos, puede explicar su actividad 10 veces mayor sobre las AFP moderadamente activas¹⁸. Aunque la eficiencia de las AFP hiperactivas está bien documentada, su capacidad para unirse a múltiples planos de hielo todavía no se entiende.

El método original para determinar los aviones de hielo ligados a las AFP fue desarrollado por Charles Knight^13,19. En este método, un solo cristal de hielo macroscópico se monta sobre una varilla metálica hueca (dedo frío) y se forma en un hemisferio sumergiéndolo en una copa hemisférica llena de agua desgastada. Luego, el hemisferio se sumerge en una solución diluida de AFP y se cultiva una capa de hielo de la solución de AFP en el hemisferio de cristal de hielo durante varias horas controladas por la temperatura del etilenglicol que circula a través del dedo frío. El cristal de hielo se retira de la solución, se desprende del dedo frío y se coloca en una sala de congelador de -10 a -15 °C. La superficie se raspa con una hoja afilada para eliminar la película superficial congelada de la solución de proteína anticongelante y se permite que el cristal de hielo sublite durante al menos 3 horas. Después de la sublimación, los planos de hielo unidos por AFP se pueden ver como patrones grabados en blanco derivados de la proteína residual. El hemisferio de hielo se puede orientar a sus ejes c ya, para localizar los planos basal y prisma del hielo, y determinar los índices de Miller de los parches grabados.

Aquí describimos una modificación del método original para determinar planos de hielo unidos a AFP, un método al que nos referimos como afinidad de plano de hielo basada en fluorescencia (FIPA)¹¹. Las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica, como la proteína fluorescente verde (GFP)^11,16,17,20,o con un tinte fluorescente unido covalentemente a la AFP^5,21. Las AFP etiquetadas fluorescentemente se adsorben en un solo cristal de hielo y se sobrecrean utilizando el mismo procedimiento experimental que los experimentos originales de grabado en hielo. La extensión de la unión de AFP al hemisferio de hielo en crecimiento se puede monitorear a lo largo del experimento utilizando una lámpara ultravioleta (UV). Una vez completado el experimento, el hemisferio puede ser sacado directamente del dedo frío y foto foto, sin sublimación. Sin embargo, si se desea, el hemisferio se puede dejar sublimar para visualizar un grabado de hielo tradicional. Las modificaciones introducidas en la metodología FIPA acortan el protocolo tradicional de grabado en hielo en varias horas. Además, existe la posibilidad de obtener imágenes simultáneas de varias AFP, cada una con una etiqueta fluorescente diferente, para visualizar los patrones superpuestos de los planos de hielo unidos a AFP.