קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות
Summary
חלבונים נגד קיפאון (AFPs) נקשרים למישורי קרח ספציפיים כדי למנוע או להאט את צמיחת הקרח. ניתוח זיקה למישור קרח (FIPA) המבוסס על פלואורסצנטיות הוא שינוי בשיטת תחריט הקרח המקורית לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP. AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי, משולבים בגבישי קרח בודדים מקרוסקופיים, ומוצגים תחת אור UV.
Abstract
חלבונים נגד קיפאון (AFPs) באים לידי ביטוי במגוון אורגניזמים קרים-קשים כדי למנוע או להאט את צמיחת הקרח הפנימית. AFPs להיקשר למישורים ספציפיים של קרח דרך משטחי הקרח שלהם מחייבים. ניתוח זיקה למישור קרח (FIPA) המבוסס על פלואורסצנטיות הוא טכניקה מותאמת המשמשת לקביעת מישורי הקרח שאליהם נקשרים ה- AFPs. FIPA מבוסס על שיטת תחריט הקרח המקורית לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP. היא מייצרת תמונות ברורות יותר בזמן ניסיוני מקוצר. בניתוח FIPA, AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי עם תג כימרי או צבע קוולנטי ואז משולבים לאט לתוך גביש קרח יחיד מקרוסקופי, אשר כבר preformed לתוך חצי הכדור ומכוון לקבוע את צירי a- ו- c. חצי הכדור הקרח הקשור ל- AFP נראה תחת אור UV כדי לדמיין מטוסים הקשורים ל- AFP באמצעות מסננים כדי לחסום אור לא ספציפי. תיוג פלואורסצנטי של AFPs מאפשר ניטור בזמן אמת של ספיחה AFP לקרח. התוויות נמצאו לא להשפיע על המטוסים שאליהם AFPs לאגד. ניתוח FIPA גם מציג את האפשרות לאגד יותר מ- AFP מתויג באופן שונה על אותו גביש קרח יחיד כדי לעזור להבדיל בין מישורי הכריכה שלהם. יישומים אלה של FIPA עוזרים לקדם את ההבנה שלנו כיצד AFPs להיקשר לקרח כדי לעצור את הצמיחה שלה ומדוע אורגניזמים רבים המייצרים AFP להביע איזופורמים AFP מרובים.
Introduction
הייצור של חלבונים נגד קיפאון (AFPs) הוא מנגנון הישרדות חשוב של אורגניזמים מסוימים שחיים בסביבות עמוסות קרח. עד לאחרונה, הוא חשב כי הפונקציה היחידה של AFPs היה למנוע או להאט את הצמיחה של גבישי קרח פנימיים שיחסמו את זרימת הדם, לגרום נזק לרקמות, ומתח אוסמוטי. אורגניזמים שאינם יכולים לסבול כל מידה של הקפאה, כגון דגים, מבטאים AFPs כדי לעכב לחלוטין את צמיחת גביש הקרח1. אחרים, כגון דשא, הם סובלניים להקפיא ולבטא AFPs כדי לעכב recrystallization קרח אשר מפחית את היווצרות גבישי קרח גדולים ברקמות שלהם2. ייצוב של ממברנות בטמפרטורה נמוכה היא עוד פונקציה שהוצעה עבור AFPs3. לאחרונה הוצע תפקיד חדש לסוכנות הידיעות הצרפתית AFP של חיידק אנטארקטיקה, מרינומונס פרימוריאנסיס, מאגמים מליחים מכוסי קרח4. זה AFP הוא חלק חלבון אדזיה הרבה יותר גדול5 כי הוא חשב לחבר את החיידק לקרח לגישה טובה יותר חמצן וחומרים מזינים6. מיקרואורגניזמים אחרים ידועים להפריש AFPs, אשר עשוי לשנות את המבנה של הקרח שבו הםחיים 7.
AFPs נמצאו כמה דגים, חרקים, צמחים, אצות, חיידקים, דיאטומים, ופטריות. יש להם רצפים ומבנים שונים להפליא התואמים את התפתחותם מאבותיהם השונים בהזדמנויות שונות; ובכל זאת כולם נקשרים לקרח ומעכבים את צמיחתו על ידי מנגנון עיכוב הספיחת8. לכל אחד מה- AFPs יש משטח ספציפי המשמש כאתר מחייב הקרח (IBS). אלה זוהו בדרך כלל על ידי mutagenesis מכוון האתר של שאריות פני השטח9-11. IBS הוא שיערו לארגן מולקולות מים בתבנית דמוית קרח שתואם מישורים ספציפיים של קרח. לכן AFP יוצר ligand שלה לפני מחייב אותו5, 12. מטוסי קרח יכולים להיות מוגדרים על ידי מדדי מילר שלהם, ו- AFPs שונים יכולים להיקשר למישורים שונים. לפיכך, סוג I AFP מ flounder החורף נקשר 20-21 מטוסים פירמידליים13, סוג III AFP קושר הן פריזמה ראשונית מטוסים פירמידליים באמצעות משטח קרח מורכב מחייב11,14, בעוד התולעת אשוחית AFP, AFP היפראקטיבי, נקשר בו זמנית הן המטוסים העיקריים הבסיסיים15,16. AFPs היפראקטיביים אחרים, כגון MPAFP, נקשרים למספר מטוסי קרח כפי שמוצג על ידי הכיסוי המלא שלהם של ההמיספרות של גבישי קרח יחיד5,17. זה המשוערות, כי היכולת של AFPs היפראקטיבי לקשור את המישור הבסיסי, כמו גם מטוסים אחרים, עשוי להסביר את הפעילות הגבוהה פי 10 שלהם על AFPs פעיל בינוני18. למרות היעילות של AFPs היפראקטיבי מתועד היטב, היכולת שלהם להיקשר למטוסי קרח מרובים עדיין לא מובן.
השיטה המקורית לקביעת מטוסי הקרח הקשורים ל-AFP פותחה על ידי צ’ארלס נייט13,19. בשיטה זו, גביש קרח יחיד מקרוסקופי מותקן על מוט מתכת חלול (אצבע קרה) ונוצר בחצי הכדור על ידי שקיעתו לתוך חצי הכדור מלא במים דלים. לאחר מכן, ההמיספרה שקועה בתמיסה מדוללת של AFPs ושכבת קרח גדלה מתמיסת AFP אל חצי הכדור של גביש הקרח במשך מספר שעות הנשלטת על ידי הטמפרטורה של האתילן גליקול במחזור דרך האצבע הקרה. גביש הקרח מוסר מהתמיסה, מנותק מהאצבע הקרה, ומונח בחדר מקפיא של -10 עד 15 מעלות צלזיוס. פני השטח מגרדים בלהב חד כדי להסיר את סרט פני השטח הקפואים של תמיסת חלבון נגד קיפאון וקריסטל הקרח מותר סובלימציה לפחות 3 שעות. לאחר סובלימציה, ניתן לראות את מישורי הקרח הכפופים ל- AFPs כתבניות חרוטות לבנות הנגזרות משורי חלבון. ניתן לכוון את חצי הכדור הקרח לציר cולצירים, לאתר את מישורי הבזל והמנסרה של הקרח, ולקבוע את מדדי מילר של הכתמים החרוטים.
כאן אנו מתארים שינוי של השיטה המקורית לקביעת AFP הקשורים מישורי קרח, שיטה שאנו מכנים זיקה מטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות (FIPA)11. AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי עם תג כימרי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)11,16,17,20, או עם צבע פלואורסצנטי קשור בקובאליות AFP5,21. AFPs שכותרתו פלואורסצנטית הם נספגים גביש קרח אחד מגודל באמצעות אותו הליך ניסיוני כמו הניסויים המקוריים תחריט קרח. ניתן לעקוב אחר היקף ה-AFP המחייב את חצי הכדור הקרח הגדל לאורך כל הניסוי באמצעות מנורת אולטרה סגול (UV). לאחר השלמת הניסוי, ניתן להוריד את חצי הכדור ישירות מהאצבע הקרה ולצלם אותה, ללא סובלימציה. עם זאת, אם תרצה, ניתן להשאיר את חצי הכדור לעובר כדי לדמיין תחריט קרח מסורתי. שינויים שהוכנסו למתודולוגיית FIPA מקצרים את פרוטוקול תחריט הקרח המסורתי בכמה שעות. בנוסף, קיים פוטנציאל להדמיית מספר AFPs בו זמנית, כל אחד עם תווית פלואורסצנטית שונה, כדי לדמיין את הדפוסים החופפים של מישורי קרח הקשורים ל- AFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתוח שיטת תחריט הקרח על ידי צ’ארלס נייט לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP קידם מאוד מחקרים על מנגנון כריכת הקרח על ידי AFPs. בעוד מבנים של AFPs יכול להיפתר על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן26,27 לא היתה שיטה ברורה להסיק את פני השטח המשלימים על הקרח שאליו AFP קשור. כאשר סוג I AFP מ flounder החורף היה מאופיין בתח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD מחזיקה בכיסא המחקר הקנדי להנדסת חלבונים. עבודה זו מומנה על ידי מענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות ל- PLD. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי של האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מס ‘23310171) ומהמוסד היפני לקידום מחקר טכנולוגי (BRAIN). אנו מודים לד”ר כריס מרשל ומייק קויפר על עבודה חלוצית שהובילה ל-FIPA. אנו גם מודים לד”ר סאקה טסודה על שסיפקה מתקנים לחלק מהעבודה הזו ולט”ר לורי גרהאם על שהקימה את מסנני עירור האור והפליטה הפלואורסצנטיים.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
