تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس
Summary
ترتبط البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) بطائرات معينة من الجليد لمنع أو إبطاء نمو الجليد. تحليل تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلورسينس (FIPA) هو تعديل للطريقة الأصلية لحفر الجليد لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس. يتم تسمية AFPs بفلورسنت ، ودمجها في بلورات الجليد الفردية العيانية ، وتصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
Abstract
يتم التعبير عن البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) في مجموعة متنوعة من الكائنات الباردة هاردي لمنع أو إبطاء نمو الجليد الداخلي. ترتبط AFPs بطائرات معينة من الجليد من خلال أسطحها الملزمة للجليد. تحليل تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلورسينس (FIPA) هو تقنية معدلة تستخدم لتحديد الطائرات الجليدية التي ترتبط بها AFPs. ويستند الاتحاد الدولي للطائرات إلى الطريقة الأصلية لحفر الجليد لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس. وتنتج صورا أوضح في وقت تجريبي مختصر. في تحليل FIPA ، يتم تسمية AFPs بعلامة ثلاثية الفلورسنت أو صبغة تساهمية ثم يتم دمجها ببطء في بلورة جليدية واحدة مجهرية ، والتي تم تشكيلها مسبقا في نصف الكرة الأرضية وموجهة لتحديد المحاور a- و c. يتم تصوير نصف الكرة الجليدي المتجه إلى وكالة فرانس برس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس باستخدام مرشحات لمنع الضوء غير المحدد. يسمح وضع العلامات الفلورية ل AFPs بمراقبة امتصاص AFP في الوقت الفعلي في الجليد. وقد تبين أن التسميات لا تؤثر على الطائرات التي ترتبط بها ال AFPs. يقدم تحليل FIPA أيضا خيار ربط أكثر من وكالة فرانس برس الموسومة بشكل مختلف على نفس بلورة الجليد الواحدة للمساعدة في التمييز بين طائراتها الملزمة. وتساعد هذه التطبيقات من FIPA على تعزيز فهمنا لكيفية ربط AFPs بالجليد لوقف نموه ولماذا تعبر العديد من الكائنات الحية المنتجة لوكالة فرانس برس عن أشكال متساوية متعددة من ال AFP.
Introduction
إنتاج البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) هو آلية هامة للبقاء على قيد الحياة لبعض الكائنات الحية التي تعيش في بيئات محملة بالجليد. حتى وقت قريب، كان يعتقد أن الوظيفة الوحيدة لAFPs هو منع أو إبطاء نمو بلورات الجليد الداخلية التي من شأنها منع الدورة الدموية، وتسبب تلف الأنسجة، والإجهاد التناضحي. الكائنات الحية التي لا يمكن أن تتسامح مع أي درجة من التجمد، مثل الأسماك، والتعبير عن AFPs لمنع نمو الكريستال الجليديتماما 1. البعض الآخر، مثل العشب، وتجميد متسامحة والتعبير عن AFPs لمنع التبلور الجليد الذي يقلل من تشكيل بلورات الجليد الكبيرة في أنسجة2. استقرار الأغشية في درجة حرارة منخفضة هو وظيفة أخرى التي اقترحت لAFPs3. في الآونة الأخيرة, واقترح دور جديد لوكالة فرانس برس من بكتيريا القطب الجنوبي, Marinomonas primoryensis, من البحيرات المالحة المغطاة بالجليد4. هذا القوات المسلحة الفلبينية هو جزء من بروتين الالتصاق أكبر بكثير5 التي يعتقد أن نعلق البكتيريا إلى الجليد للحصول على أفضل الوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية6. ومن المعروف أن الميكروبات الأخرى تفرز AFPs ، والتي قد تغير بنية الجليد الذي يعيشون فيه7.
تم العثور على AFPs في بعض الأسماك والحشرات والنباتات والطحالب والبكتيريا والدياتومات والفطريات. لديهم تسلسلات وهياكل متباينة بشكل ملحوظ بما يتفق مع تطورها من أسلاف مختلفين في مناسبات مختلفة؛ وحتى الآن أنها ترتبط كل الجليد وتمنع نموه من قبل آلية الامتزاز تثبيط8. ولكل من هذه الأنظمة سطح محدد يعمل كموقع ملزم للجليد. وقد تم تحديد هذه عادة عن طريق تولد موقع موجهة من بقايا السطح9-11. ويفترض أن IBS لترتيب جزيئات الماء في نمط يشبه الجليد الذي يطابق طائرات محددة من الجليد. لذلك يشكل القوات المسلحة الفلبينية ليغاند قبل ملزمة لها5, 12. يمكن تعريف طائرات الجليد من خلال مؤشرات ميلر الخاصة بها ، ويمكن أن ترتبط AFPs المختلفة بطائرات مختلفة. وهكذا، نوع I AFP من الشتاء يتخبط يربط إلى 20-21 طائرات هرمية13، نوع III AFP يربط كل من المنشور الأولي والطائرات الهرمية باستخدام سطح مجمع الجليد ملزمة11،14، في حين أن شجرة التنوب budworm AFP، وكالة فرانس برس مفرط النشاط، يربط في وقت واحد إلى كل من الطائرات الأولية والبازلية15،16. أخرى AFPs مفرط، مثل النائبوكالة الصحافة الفرنسية، ربط طائرات الجليد متعددة كما هو مبين من خلال تغطيتها الكاملة لنصف الكرة الأرضية الكريستال الجليد واحد5،17. ومن المفترض، أن قدرة AFPs مفرط لربط الطائرة القاعدية، فضلا عن طائرات أخرى، قد تمثل نشاطهم أعلى 10 أضعاف على AFPs نشطةمعتدلة 18. على الرغم من أن كفاءة AFPs مفرط موثقة بشكل جيد ، إلا أن قدرتها على الارتباط بطائرات جليدية متعددة لا تزال غير مفهومة.
تم تطوير الطريقة الأصلية لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس من قبل تشارلز نايت13،19. في هذه الطريقة ، يتم تركيب بلورة جليدية واحدة مجهرية على قضيب معدني مجوف (الإصبع البارد) وتشكلت في نصف الكرة الأرضية عن طريق غمرها في كوب نصف كروي مملوء بالماء غير المغص. ثم، يتم غمر نصف الكرة الأرضية في محلول مخفف من AFPs وتزرع طبقة من الجليد من محلول AFP على نصف الكرة الأرضية الكريستالي الجليدي على مدى عدة ساعات تسيطر عليها درجة حرارة جلايكول الإيثيلين المتداولة من خلال الإصبع البارد. تتم إزالة الكريستال الجليد من الحل، منفصلة عن الإصبع البارد، ووضعها في غرفة التجميد -10 إلى -15 درجة مئوية. يتم كشط السطح بشفرة حادة لإزالة الفيلم السطحي المجمد لمحلول البروتين المضاد للتجمد ويسمح لكريستال الجليد بالتسامي لمدة 3 ساعات على الأقل. بعد التسامي، يمكن النظر إلى الطائرات الجليدية المقيدة ب AFPs على أنها أنماط محفورة بيضاء مشتقة من البروتين المتبقي. يمكن توجيه نصف الكرة الجليدي إلى محوره cوفؤوسه ، لتحديد موقع الطائرات القاعدية والمنشور من الجليد ، وتحديد مؤشرات ميلر للبقع المحفورة.
هنا نصف تعديل الطريقة الأصلية لتحديد الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس من الجليد ، وهي طريقة نشير إليها باسم تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلور (FIPA)11. وصفت AFPs الفلورسنت مع إما علامة الشميريك، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)11،16،17،20، أو مع صبغة الفلورسنت ملزمة بشكل متناقض إلى وكالة فرانس برس5،21. يتم تسمية الفلورسنت AFPs ممتزة ببلورة جليدية واحدة ومتضخمة باستخدام نفس الإجراء التجريبي مثل تجارب حفر الجليد الأصلية. ويمكن رصد مدى ارتباط وكالة فرانس برس لنصف الكرة الجليدي المتنامي طوال التجربة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. بعد اكتمال التجربة ، يمكن أن يؤخذ نصف الكرة الأرضية مباشرة من الإصبع البارد وصوره ، دون تسامي. ومع ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن ترك نصف الكرة الأرضية لتتسامي لتصور حفر الجليد التقليدي. وتقلل التعديلات التي أدخلت على منهجية الاتحاد الدولي للجليد من البروتوكول التقليدي لحفر الجليد بعدة ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك إمكانية لتصوير عدة AFPs في وقت واحد ، كل منها مع تسمية فلورية مختلفة ، لتصور الأنماط المتداخلة للطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطوير طريقة حفر الجليد من قبل تشارلز نايت لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس دراسات متقدمة إلى حد كبير حول آلية ربط الجليد من قبل AFPs. وفي حين يمكن حل هياكل الملوثات المضادة للتسرب عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية26,27، لم تكن هناك طريقة واضحة لتطوير السطح التك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يحمل PLD كرسي البحوث الكندية في هندسة البروتين. وقد مول هذا العمل بمنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية إلى وزارة الصحة. كما تم دعم هذا العمل بمنحة في المعونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (رقم 23310171) ومن المؤسسة اليابانية لتقدم بحوث التكنولوجيا ذات التوجه الحيوي (BRAIN). ونحن ممتنون للدكتورين كريس مارشال ومايك كويبر على العمل الرائد الذي أدى إلى الاتحاد الدولي للقوات المالية. كما أننا ممتنون للدكتور ساكاي تسودا على توفير المرافق لبعض من هذا العمل والدكتور لوري غراهام لإعداده فلاتر الإثارة الضوئية الفلورية والانبعاثات.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
