Summary

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している<em> Batrachochytriumのdendrobatidis</em>両生類の感染

Published: March 14, 2014
doi:

Summary

両生類におけるBatrachochytriumのdendrobatidis感染が低減濃度(0.0025%)、および一般的に使用されるよりもイトラコナゾールの短い持続時間(6日間5分浴)を用いて除去することができる。以下で死亡率およびより少ない負の副作用は、この修飾治療プロトコルを用いて観察した。

Abstract

両生類は、任意の脊椎動物クラスの最大の下落を経験しているし、これらの減少の主な原因は、疾患ツボカビを引き起こす真菌の病原体、Batrachochytriumのdendrobatidis(BD)、である。キャプティブ保証コロニーが絶滅両生類で世界的に重要であり、絶滅の重大な脅威のそれらのための唯一の生命線である。無病コロニーを維持することは、キャプティブ経営者の優先事項である、まだすべての種のため、ライフステージ全体で安全かつ効果的な治療が同定されていない。一般的に使用される投与量は、いくつかの個人や種に害を及ぼす可能性があるが、最も広く使用されている化学療法は、イトラコナゾールである。我々は、イトラコナゾールの低い、より安全で効果的な投与量は、Bdの感染症を治すために見つけることができるかどうかを評価するための臨床治療の治験を行った。我々は発見した0.01から0.0025パーセント処理濃度を低下させ、11から処理時間を減少させることによって5分浴の-6日間、カエルは副作用が少ないと少ない治療に関連した死亡 BD感染硬化させることができた。

Introduction

両生類は現在、すべての脊椎動物の分類群1の生物多様性の最大の下落を経験している。ツボカビ、ツボカビ真菌病原体Batrachochytriumのdendrobatidis(BD)によって引き起こされる皮膚病、これらの劇的な下落2の主要な原因の1つであるBdは生物多様性の損失を生じさせるための記録最悪病原体である:それは両生類の600以上の種に感染し、持ってできるだけ多く200種が絶滅危惧または2,3絶滅したそのうちの300種以上の減少を引き起こした。両生類ツボカビ菌は、特定のホストされていない、それ 、BD 感染が深刻な病気を引き起こす進行するためにホストの資質が許すかは不明である。ツボカビは、電解質の損失および心不全4で得られた、皮膚におけるイオンチャネルを破壊することによって死を引き起こす。また、(何のBdの遊走子を含まない) のBd上清オタマジャクシ5最先端レベルの免疫応答を引き起こすGの研究者 、BD 、副生成物6毒性を生産信じています。

多くの種が急速に減少しているため、キャプティブ保証コロニー繁殖プログラムは、重要な保全対策であり、いくつかの種のための唯一の生命線である。確立し、無病コロニーを維持することは両生類管理施設のための挑戦である。 Bdの感染症を治療するための現在の化学療法の方法は、有効であるが、治療される動物に有害であることができ、単一の治療法は、種および両生類7歳クラスの両端に成功しなかった。

Bdの感染治療のいくつかの臨床試験では、07行われている。治療の三最も一般的に使用される方法は、温熱療法、クロラムフェニコールおよびイトラコナゾールである。温熱療法は、ほとんど副作用を有すると思われるnonchemotherapeutic治療選択肢である複数のライフステージで使用することができ、GENERである同盟国効果的。治療試験では、チャットフィールドとリチャーズ- Zawacki 8は、処置した動物の96%が10日間30°Cに収容された後、感染をクリアしていたことが分かった。この試験は100パーセント成功しませんでしたが、それは他の人が自分の種のための温熱療法を評価するためのベースラインを提供しています。温熱療法は、多くの種に有効であるが、長時間にわたって高温に留まることができない多くの高山種について非実用的である。クロラムフェニコール、抗菌性は、多くの種でのBdを治療するために成功裏に使用され、 インビトロでの真菌の成長を阻害されている。抗菌ように、クロラムフェニコールは、具体的には真菌を攻撃しないが、真核細胞9においてアポトーシスを引き起こすことが知られている。これは、作用の正確なメカニズムは不明であるが、クロラムフェニコール療法は、細胞内の胞子を死滅させる、皮膚におけるアポトーシスを引き起こすことが推測されている。臨床試験は行われないので、したが用量および治療 ​​時間が評価されておらず、現在の治療プロトコルは、典型的には、地上両生類のためのこの治療は実用的でない、2〜4週間10,11のための浸水を必要とする。ヒトへの暴露は、再生不良性貧血12のまれな形態と関連していたので、クロラムフェニコールはまた、獣医学的使用のためのいくつかの国で制限されています。

イトラコナゾール、アゾール系抗真菌は、最も広く飼育されている両生類のBd感染治療のために使用される。最も広く使用されるプロトコルは、5分11日間連続日の0.01%イトラコナゾール溶液中に入浴動物である。このプロトコルは、両生類のために有効であるが、それは両生類11,13での臨床試験に基づくものではない、哺乳動物への投与に使用される基準に由来した。このプロトコルは、特に属ラナにし、オタマジャクシ、最近metamorphs 11で、特定の種の負の副作用を引き起こす可能性があります。オタマジャクシ処理は、イトラコナゾールのはるかに低い濃度(0.0005%)を用いて成功しているが、脱色14と関連していた。これと同じ濃度は、最近のmetamorphsでトライアルが行われ、感染15の治療に失敗したことが判明した。イトラコナゾール治療によるマイナスの副作用の危険性がありますので、いくつかの専門家は、11日間連続して1の半分の通常の濃度(0.005%)を使用し、これ BD 感染16を硬化させることに成功したことが判明しました。

本研究で 、BD 感染 15を治療するためのイトラコナゾールを使用して臨床治療試験の要約である。プロトコルは、イトラコナゾール BD感染動物の治療のための安全かつ効果的である最低用量や治療時間を見つけるための試みを説明しています。本研究で使用した動物は、湾岸のヒキガエルの最近のmetamorphs、Incilius nebuliferた。

Protocol

倫理承認:本研究は、そのメソッドは、チューレーン大学の動物への使用、およびケア委員会(。プロトコルなし0407)によって承認された。 1。 Bdの感染症の検査 BD用拭き取り無菌綿棒で綿棒動物ventrumに5回、各太もも、それぞれの側、および45ストロークの合計各肢に5回。拭き取りは両生類の皮膚にBD用のサンプリングの?…

Representative Results

すべての動物は、治療が終わった4週間後にBD-陰性であった場合は、イトラコナゾール治療が成功したと考えられた。治療が開始される前に、2週間接種後、全てのBD-接種した動物は、治療後4週が終了している間、BD-陽性対照動物は(16,765.12の平均遊走子負荷を持っていた、(17.34±)1,121.7の平均遊走子負荷で、感染していた)14643.08±。 Incilius nebuli…

Discussion

このプロトコルを用いて、我々は、安全かつ効果的に両生類でBdのためのイトラコナゾール処置の治療投与量と時間を削減することができた。最低治療用量および時間(6日間0.0025%)は無症状感染Iについて治療の成功だったnebulifer。低用量と治療時間の両方の有効性は、両生類のすべての種と年齢のクラスに使用すべき安全かつ効果的な治療法はまだありませんよう?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私は中の助けを実験計画を概念と素材を支援、治療レジメンと剖検を確立する助けA. Pessier分析し、MWHチャットフィールド、MJ Robak、K.タスカーとDレンゲルヘルプCLリチャーズ-Zawackiに感謝したいと思います研究室や撮影中にそのスペースを使用するためのサポートとタロンガ動物園でのM·マクファデンとP.ハーロウ。プロジェクトは、部分的に、LA Brannellyに授与ルイジアナ州環境教育委員会の許可を経てライフ·テクノロジーズによって野生生物水産ルイジアナ州省によって資金を供給された。

Materials

0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl Fisher Scientific S640-500
KCl Fisher Scientific BP366-1
CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
1.5 ml micro tubes Sarstedt 73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
VIC IPC Applied Biosystems 4308323
BSA Applied Biosystems AM2618
Agar Invitrogen 30391023
Tryptone Invitrogen Q10029
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
  4. Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
  5. Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
  6. McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
  7. Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
  8. Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
  9. Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
  10. Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey’s frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
  11. Pessier, A. P., Mendelson, J. . A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , (2009).
  12. Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
  13. Yoon, H. -. J., Seo, M. H., Kim, J. -. K. . Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
  14. Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
  15. Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
  16. Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
  17. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
  18. Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
  19. Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
  20. Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).

Play Video

Cite This Article
Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

View Video