Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.
Nöronal morfolojilerinden ve göç de dahil olmak üzere beyinde gelişimsel olaylar son derece In vitro. Süreçlerini yönetti ve in vivo bu olaylara karışan yolları belirlemek için derinlemesine bir nitelemeye imkan analiz edilmektedir. Gelişen beyincikte türetilen serebellar nöronlar granül (CGNs) morfolojik analiz için ideal bir model sağlayan bir sistemi vardır. Burada, bir genetik CGNs işlemek için bir yöntem ve ne kadar bireysel nöronların axono ve dendritogenesis çalışma açıklar. Bu yöntemle RNA girişim, aşırı ifadesi ya da küçük moleküllerin etkileri nöronlar kontrol ile karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, kemirgen serebellar korteks baskın sonrası gelişim sayesinde vivo sistemde kolay erişilebilir. Ayrıca, genetik olarak gelişen cerebella işlemek ve daha sonra serebellar tanımlamak için bir in vivo elektroporasyon tekniği mevcut nöronal morfoloji değerlendirmek için analiznd göç.
Beyincik akson büyüme ve göç mekanizmaları incelemek için mükemmel bir sistemdir. Beyincik nörobilim 1 çağlarından itibaren anatomik çalışmaların konusu olmuştur. Modern mikroskobu ve immunohistokimyasal teknikler önemli ölçüde genişletilmiş ve Santiago, Ramon ve üreter, 2-4 ile ilk keşifler rafine var. Fare genetik ve moleküler çalışmalar serebellar granül nöronların (CGNs) 5-7 gibi nöronlar farklı düzgün kablolama için gerekli önemli olayların daha iyi anlaşılmasına yol açan, serebellar gelişme kontrolünde temel büyüme ve transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkardı.
Beyincik gelişmekte olan arka beyin 8 rhombomere 1 bir türevidir. 4. ventrikül çatı parçası olan eşkenar paralel dudak, en çok nöron popülasyonu oluşturacak serebellar granül nöron progenitörlerinin, yol açaryetişkin beyincik 9. Rostral göç, onlar serebellar anlage yerleşmek. Burada, granül nöron öncülerin mitoz kemirgenlerde doğumdan yer alan granüler tabaka, dış (EGL), dramatik genişlemesine yol açar. EGL itibaren, nöronlar Purkinje hücre tabakası sonuçta iç granüler tabaka (IGL 2) ikamet almak için geçmiş, moleküler tabakası (ML) ile içe göç başlar. Bu göç işlemi sırasında iki aksonlar ML içine uzanan iki kutuplu bir şekil kazanır. Ayrıca geçiş üzerine, hücre gövdesi uzakta aksonlardan göç ve iki işlem, bir çatallı, T-şekilli bir akson 10 oluşturmak için sigorta. Daha sonra, bu bölümler halinde ve akson olarak paralel lifler adlandırılır. IGL yerleşince, CGNs yosunlu lifleri ile sinaps kurmak dendritik pençeleri oluşturur dendrit, büyür. , Gelişen beyincikte temel süreçleri incelemek için, bir in vitro ve in vivo yaklaşımların bir arayah güvenilir sonuçlar ve sonuçlar sağlar.
CGNs sadece beyincik ancak tüm beynin en çok nöronlardır ve yüksek saflıkta 11-13 için kültürlenebilir. Kültürde, bu son derece homojen nöronal nüfusu hızla postmitotic olur ve kolayca tanımlanabilir akson ve dendritler ile bir polar morfoloji kazanır. Kültürlü CGNs progenitör çoğalma, farklılaşma, akson ve dendrit gelişim, nöronal göç, apoptoz ve elektrofizyolojik özellikleri (14-19 ve diğerleri) içeren sinirsel gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Genetik manipülasyon kullanımı kültürlü CGNs çok yönlülüğünü genişletilmiş ve yukarıda belirtilen olayların içine daha fazla mekanik içgörü için izin verdi. Verimliliği düşük kalsiyum fosfat veya kutup işaretleri veya yazılım destekli analiz olanakları ile immünsitokimya ardından lipofilik yöntemleri kullanarak kültürlü nöronların transfeksivonuyoğun bir nöronal kültüründe bireysel nöronların örneğin morfolojisinin değerlendirilmesi tates. Bu yaklaşımla, akson ve dentrit büyümesi ilgi konusu olan proteinlerin rolü 20-25,26-28 incelenebilir. Bu kültür sistemi, bununla birlikte göç çok yüksek yoğunluklu kültürde sınırlı olduğu nöronal göç analiz etmek için daha az yararlıdır ve alt kültürleri olarak gerektirir. Akson ve dentrit büyümesi in vitro analiz, RNA girişim (i) kombinasyonlarını kullanarak bir sinyal yolunun bağlantılı proteinlerin inceleme sağlar, fazla sentezlenme ya da küçük moleküller.
Akson ve dentrit büyümesi düzenleme ya da nöronal göç ilgilenilen proteinin ilişkisini kurmak için, in vivo elektroporasyon (İVE) tekniği gelişmekte serebellar korteks analizi sağlar. Kemirgenlerde serebellar gelişme ilk iki doğum sonrası haftalara şekilde uzanan gerçeği nedeniyle, beyincik bir accessib temsil ederakson ve dendrit, nöronal göç, sinaptogenez ve apoptoz 20-24,29,30,26,27,31-34 gelişmekte incelemek için genetik manipülasyonlar le beyin yapısı. Buna ek olarak, bu model sistemi, aynı zamanda, akson yol bulma, kablo ve Birlikte alındığında nöronlar ve nöron-glia etkileşimlerinin bağlantısı gibi sağlam serebellar korteks gerektiren nöronal gelişimin diğer yönleri için faydalıdır, bu protokol, in vitro ve in vivo teknikler mücadele sağladığı nöronal morfolojilerinden ve göç konusunda tamamlayıcı bir yaklaşım.
Avantajları ve in vitro ve in vivo metotları tarif sınırlamaları:
Fare ve sıçan Kültür CGNs eşit derecede iyi morfolojik analizler için uygundur. Bir sıçan beyincik büyük boyutu sayesinde, sıçan yavrularından CNGs verim fare yavrularının 3-4x o aşıyor. Kenara CGNs gelen, kortikal ve hipokampal nöronların yanı sıra kültür sistemi olarak kullanılabilir. Kalsiyum fosfat yöntemi bireysel nöronların morfolojisini analiz etmek için arzu edilen bir…
The authors have nothing to disclose.
Biz istatistiksel analizler ile yardım için, mükemmel teknik yardım C. Hammer ve S. Papiol N. Schwedhelm-Domeyer teşekkür ederim. Çalışmalarımız Max Planck Derneği, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Nanoseviye Mikroskopi Merkezi ve Beyin Moleküler Fizyoloji (CNMPB), Göttingen, Almanya ve Göttingen Üniversitesi GGNB Gençler Grubu Stipend tarafından finanse edilmektedir.
DMEM | Gibco | 11960-044 | |
BME | Gibco | 41010-026 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
SP2 confocal microscope | Leica | ||
ImageJ | NIH | ||
Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
MS Excel | Microsoft | ||
Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |