Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em> Listeria monocytogenes</em

La bacteria Gram positiva Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por los alimentos que invade las células huésped, interrumpe su vacuola internalización y se replica en el citoplasma de las células huésped ^1. L. monocytogenes facilidad de manipulación en el contexto de laboratorio (rápido crecimiento, baja toxicidad para los individuos sanos) asociado con la persistencia de rasgos de virulencia bacterianas observadas en modelos celulares y animales (actividad hemolítica, leucocitosis) permite su uso inicial en la década de 1960 como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular y para el establecimiento de los fundamentos teóricos de la inmunidad celular contra la infección ^2. A finales de 1980 y principios de 1990, la disección del ciclo intracelular bacteriano ^3, así como la caracterización molecular de la virulencia bacteriana más importante factores de ^4-7 favoreció el uso de L. monocytogenes como una herramienta clave molecular para la manipulación y el pernoy de las funciones de la célula huésped. La presencia de no virulenta (L. innocua) y (Listeria monocytogenes) especies virulentas en el género Listeria allanaron el camino para estudios genómicos comparativos ⁸ que, junto con la reciente creación de la completa L. monocytogenes transcriptoma ^9, han aumentado nuestra comprensión de la evolución de la L. monocytogenes como un patógeno humano y como un sistema modelo para estudios de infección ^10.

L. monocytogenes induce su internalización en las células huésped en la interacción de las proteínas de la superficie bacteriana INLA y InlB con sus receptores de células huésped E-cadherina y Met, respectivamente ^11-12. Estudios basados ​​en la candidata inicial condujeron a la identificación del enlace cateninas-actina α / β como un componente importante de la vía ^InlA-13 y la invasión de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI 3-K) como un efector crítico de la InlB- casca invasión dependientede ^14-15. Ensayos proteómicos y basados ​​funcional posteriormente permitieron la identificación de nuevos elementos del citoesqueleto y ¹⁶ segundos mensajeros lipídicos ¹⁷ requeridos para la invasión de la célula huésped. Estudios transcripcionales ¹⁸ y proteómica cuantitativa basada en la espectrometría de masas ¹⁹ se han esclarecido algunos puntos en relación con la activación de cascadas de señalización de acogida y la represión de la respuesta inmune durante la L. monocytogenes infección. La biología de sistemas se acerca basado en la inactivación de los grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeños ARN de interferencia (siRNA) silenciamiento se han abierto recientemente nuevas vías para el análisis de la serie mundial de las cascadas de señalización en el contexto de las funciones celulares específicas, incluyendo la fagocitosis y internalización patógeno ^20. Pantallas siRNA del genoma completo han realizado anteriormente para investigar cascadas celulares requeridos para la infección de L. monocytogenes en fagocítica Drosophila </eM> células S2 ^21-22, pero este tipo de análisis no ha sido realizado en las células no fagocíticas, que representan objetivos críticos para la infección in vivo.

Hemos optimizado un protocolo para la detección microscópica de las etapas tardías de la infección por L. monocytogenes que es adecuado para siRNA estudios de alto rendimiento de la entrada de bacterias dentro de las células epiteliales. Nuestro ensayo se aprovecha de una L. altamente invasiva monocytogenes cepa que presenta una mutación puntual en PrfA, el principal regulador de la transcripción de L. monocytogenes factores de virulencia ^6: esta mutación (llamado PrfA *) hace que PrfA constitutivamente activa ²³ y conduce a un aumento de la expresión de las proteínas de invasión inlA y InlB, por lo tanto, favorecer la entrada de bacterias en células no fagocíticas de lo contrario pobremente infectados. Nuestra lectura para la infección se basa en la detección de la acumulación citosólica de la secretada InlC proteína bacteriana: esta molécula esun efector pleiotrópica que se expresa preferentemente por intra-citoplasmática L. monocytogenes ⁹ y que participa no sólo en la célula de células-a-bacteriana propagan ²⁴ pero que también modula las respuestas inmunes del huésped ^25. El marcaje fluorescente de la secreción de InlC por bacterias intracelulares no sólo permite distinguir claramente infectado a partir de células no infectadas, sino que también representa una lectura de punto final que se puede utilizar para diseccionar posteriormente infección en sus diferentes pasos: entrada, de escape vacuolar, citosólica bacteriana la proliferación y propagación de célula a célula. Este protocolo basado en microscopía-puede estar acoplado a las pantallas de siRNA por lo tanto, para estudiar las vías celulares implicadas en la infección de células huésped por L. monocytogenes.