Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em> Listeria monocytogenes</em

De Gram positieve bacterie Listeria monocytogenes is een voedsel overgedragen pathogeen dat gastheercellen valt, verstoort de internalisatie vacuole en repliceert in het cytoplasma van gastheercellen ^1. L. monocytogenes gemak van manipulatie in het laboratorium context (snelle groei, een lage toxiciteit voor gezonde personen) in verband met het voortbestaan ​​van bacteriële virulentie eigenschappen waargenomen in cellulaire en diermodellen (hemolytische activiteit, leukocytose) toegestaan ​​het eerste gebruik in de jaren 1960 als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasitisme en voor de oprichting van de theoretische grondslagen van cellulaire immuniteit tegen infectie ^2. In de late jaren 1980 en begin jaren 1990, de ontleding van de intracellulaire bacteriële cyclus ³ en de moleculaire karakterisatie van de belangrijkste bacteriële virulentiefactoren ^4-7 voorkeur het gebruik van L. monocytogenes als een belangrijke moleculaire tool voor de manipulatie en study gastheercel functies. De aanwezigheid van avirulent (L. innocua) en virulente (L. monocytogenes) soorten in het geslacht Listeria de weg vrijgemaakt voor comparative genomic studies ⁸ die, samen met de recente oprichting van de volledige L. monocytogenes Transcriptome ^9, ons begrip van de evolutie van L. zijn toegenomen monocytogenes als een menselijk pathogeen en als een modelsysteem voor infectie studies ^10.

L. monocytogenes induceert de internalisatie in gastheercellen na interactie van de bacteriële oppervlakte-eiwitten sture en InlB met hun gastheercel receptoren E-cadherine en Met respectievelijk ^11-12. Eerste-kandidaat gebaseerde studies leidden tot de identificatie van de α / β-actine catenins verbinding als een belangrijk onderdeel van de inla-invasie route ¹³ en de fosfoinositide 3-kinase (PI3-K) als een kritische effector van InlB- afhankelijke invasie Cascade ^14-15. Proteomics en functionele assays op basis daarna kon de identificatie van nieuwe cytoskelet elementen ¹⁶ en lipide second messengers ¹⁷ vereist gastheercel invasie. Transcriptionele studies ¹⁸ en massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics ¹⁹ hebben onlangs een nieuw licht werpen met betrekking tot de activering van gastheer signaleringscascades en de onderdrukking van de immuunrespons tijdens L. monocytogenes infectie. Systeembiologie aanpak gebaseerd op de inactivatie van grote sets van genen (kinomes, complete genomen) door kleine interfererende RNA (siRNA) silencing hebben onlangs nieuwe wegen geopend voor de analyse van de wereldwijde gastheer signaleringscascades in het kader van specifieke cellulaire functies, met inbegrip van fagocytose en pathogeen internalisatie ^20. Genoom-brede siRNA schermen zijn eerder uitgevoerd om cellulaire cascades die nodig zijn voor infectie van L. onderzoeken monocytogenes in fagocytaire Drosophila </em> S2 cellen ^21-22, maar dit type analyse is niet uitgevoerd in niet-fagocytische cellen, die kritisch doelstellingen voor infectie in vivo vertegenwoordigen.

We hebben een protocol geoptimaliseerd voor de microscopische detectie van late stadia van de infectie door L. monocytogenes die geschikt is voor hoge-doorvoer siRNA studies van bacteriële binnenkomst epitheelcellen. Onze test maakt gebruik van een zeer invasieve L. monocytogenes-stam die een puntmutatie in PRFA, de belangrijkste transcriptionele regulator van L. presenteert monocytogenes virulentiefactoren ^6: deze mutatie (genaamd PRFA *) maakt PRFA constitutief actief ²³ en leidt tot een verhoogde expressie van de invasie eiwitten ing en InlB derhalve de voorkeur bacteriële binnenkomst in zich moeilijk geïnfecteerde niet-fagocytische cellen. De uitlezing voor infectie is gebaseerd op de detectie van de cytosolische accumulatie van de uitgescheiden bacteriële eiwitten InlC: Dit molecuuleen pleiotroop effector die bij voorkeur wordt uitgedrukt door intracytoplasmatische L. monocytogenes ⁹ en die participeert niet alleen in de bacteriële cel-cel verspreiding ²⁴ maar ook moduleert gastheer immuunreacties ^25. De fluorescente labeling van InlC secretie door intracellulaire bacteriën kan niet alleen duidelijk onderscheid geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde cellen, maar vertegenwoordigt een eindpunt uitlezing die gebruikt kan worden om vervolgens ontleden infectie bij de verschillende stappen: ingang, vacuolaire ontsnappen, cytosolische bacteriële proliferatie en cel-naar-cel verspreiding. Deze microscopie protocol kan worden gekoppeld met siRNA schermen derhalve cellulaire routes betrokken bij de infectie van gastheercellen door L. bestuderen monocytogenes.