Fluorescenza<em> In situ</em> Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti
Summary
Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.
Abstract
Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è un nome dato a una varietà di tecniche comunemente utilizzate per la visualizzazione trascritti genici in cellule eucariotiche e può essere ulteriormente modificato per visualizzare altri componenti della cellula come l'infezione con virus e batteri. Localizzazione spaziale e la visualizzazione di virus e batteri durante il processo di infezione è un passo essenziale che integra espressione profiling esperimenti come microarrays e RNAseq in risposta a diversi stimoli. Comprendere le infezioni spazio-temporali con questi agenti integra esperimenti biologici volti a comprendere la loro interazione con componenti cellulari. Diverse tecniche di visualizzazione dei virus e batteri come sistemi gene reporter o metodi immunoistochimici richiedono molto tempo, e alcuni sono limitati a lavorare con organismi modello e coinvolgere metodologie complesse. FISH destinato RNA o DNA specie nella cella è un me relativamente facile e veloceThOD per studiare la localizzazione spazio-temporale di geni e per scopi diagnostici. Questo metodo può essere robusto e relativamente facile da attuare quando i protocolli impiegano breve ibridazione, sonde commercialmente acquistati, che non sono costosi. Ciò è particolarmente robusto quando la preparazione del campione, la fissazione, ibridazione, e la visualizzazione microscopica non comportano passaggi complessi. Qui si descrive un protocollo per la localizzazione di batteri e virus nei tessuti insetti e vegetali. Il metodo si basa sulla preparazione semplice, fissazione, e l'ibridazione dei monti interi insetti e organi sezionati o parti di impianti fatti a mano, con 20 paia di basi sonde di DNA brevi coniugati con coloranti fluorescenti sul loro 5 'o 3' finisce. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di tessuti insetti e vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l'espressione di mRNA o altre specie di RNA o DNA nella cellula.
Introduction
Quando studio delle interazioni tra virus vegetali e altri patogeni con i loro ospiti vegetali infetti, è importante visualizzare i patogeni e relativi acidi nucleici in situ, indipendentemente dal fatto che causano effetti negativi sulla loro ospiti. Questo è molto importante quando si studia il movimento patogeno all'interno e tra le cellule vegetali. Nella localizzazione in situ di prodotti genici del patogeno è un passo essenziale che integra altri approcci per studiare il processo di patogenicità. Molti agenti patogeni delle piante, in particolare virus, vengono trasmessi da insetti, avendo interazioni complesse e intime con i loro vettori. La localizzazione di questi virus nei loro vettori è importante per studiare il percorso per la trasmissione, e le possibili siti di interazione all'interno del vettore. La trasmissione di alcuni virus delle piante insetto-vectored è aiutata da batteri endosimbiontica che risiedono all'interno di questi insetti. Per studiare meglio la trasmissione di questi virus vegetali by loro vettori, è anche indispensabile per visualizzare i batteri endosimbiontica in generale, e quelli coinvolti nella trasmissione del virus, in particolare. Colocalizzazione dei batteri virus e endosimbiontica è quindi desiderato per indagare le possibili relazioni tra questi organismi, nel loro ospite insetti. A parte la trasmissione del virus, batteri endosimbiontica influenzano diversi aspetti della biologia di insetti vettori, la localizzazione così spaziale di questi batteri all'interno di insetti è di grande interesse e importanza.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) è il più importante complesso malattia virale di pomodoro coltivata in tutto il mondo 1-4. TYLCV è un virus floema limitata ed è vectored esclusivamente dalla mosca bianca Bemisia tabaci 5,6. Un modello che descrive la traslocazione di begomoviruses nei loro vettori mosche bianche è stato proposto 6-9. Due ostacoli specifici sono attivamente attraversati duranteing questa trasmissione circulative: midgut / emolinfa e le barriere ghiandole emolinfa / salivari. Questo processo di trasmissione si ipotizza essere mediata da recettori sconosciute che riconoscono il capside del virus. TYLCV è pensato per attraversare B. tabaci midgut 6,10, e viene assorbito attraverso la ghiandola salivare primario 6 prima di essere iniettato nella pianta. Nel emolinfa mosca bianca, TYLCV interagisce con una proteina GroEL prodotta dal batterio insetto endosimbiontica secondario Hamiltonella. Questa interazione garantire un trasporto sicuro del TYLCV nella emolinfa, e lo protegge dagli attacchi del sistema immunitario degli insetti 11. Hamiltonella e Portiera, il endosymbiont primario di mosche bianche, sono alloggiati in bacteriocytes, cellule di insetto si trovano nelle emolinfa e la casa endosimbiontica batteri 11. B. tabaci ospita batteri endosimbiontica aggiuntive, tra cui Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, e FritschEA, che può essere localizzata all'interno o all'esterno dei bacteriocytes, e hanno diversi effetti sulla biologia dell'insetto 12.
Diversi studi hanno cercato di studiare la localizzazione di TYLCV in piante e whiteflies utilizzando protocolli in termini di tempo e costosi quali microscopia elettronica a trasmissione (TEM), anticorpi e RNA in situ su sezione di spessore microscopico 10,13, uno studio recente ha descritto la localizzazione dei virus delle piante all'interno delle loro piante e vettoriali padroni di casa utilizzando un semplice protocollo 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la localizzazione di TYLCV in B. tabaci sezionato midguts e delle ghiandole salivari, e nelle sezioni preparato da piante TYLCV da HIV. Descriviamo ulteriormente la localizzazione della Portiera, il endosymbiont primario di B. tabaci, e le sue endosimbionti secondarie Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di sonde di DNA corti, chesono fluorescente sulla loro estremità 5 ', e specificamente ibridarsi sequenze complementari a sequenze di geni virali o batterici. Il campione di trasformazione è relativamente facile e il segnale ottenuto è altamente specifico. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare virus, batteri e altri agenti patogeni nel loro vegetali, animali e insetti host, e può inoltre essere utilizzato per localizzare mRNA in un dato tessuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui per la localizzazione di un virus vegetale nella sua pianta ospite e dell'insetto vettore, e batteri endosimbiontica nel loro ospite whitefly specifico, può essere adattato per la localizzazione di altri virus in piante e anche nei tessuti animali. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per localizzare batteri endosimbiontica e patogeni e altri microrganismi in sistemi vegetali e animali. I metodi descritti si basano sul semplice concetto di ibridazione tra breve, fluorescenza mar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca in laboratorio Ghanim è stato supportato da assegno di ricerca n. 908-42.12/2006 dal tedesco-israeliano Foundation (GIF), Grant no. IS-4062-07 dagli Stati Uniti e Israele binazionale agricolo di Ricerca e Sviluppo Fund (BARD), e assegno di ricerca n. 884/07 da Israele Science Foundation (ISF) per MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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