Fluorescence<em> In situ</em> Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d'insectes tissus
Summary
Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.
Abstract
Hybridation in situ fluorescente (FISH) est un nom donné à une variété de techniques couramment utilisées pour la visualisation de la transcription de gènes dans des cellules eucaryotes et peuvent être en outre modifiées pour visualiser d'autres composants dans la cellule telles que l'infection par des virus et des bactéries. Localisation spatiale et la visualisation des virus et des bactéries au cours du processus d'infection est une étape essentielle qui vient compléter le profil d'expression des expériences comme les puces et RNAseq en réponse à différents stimuli. Comprendre les infections spatio-temporelles avec ces agents complète expériences biologiques visant à mieux comprendre leur interaction avec les composants cellulaires. Plusieurs techniques de visualisation des virus et des bactéries telles que les systèmes de gènes rapporteurs ou des méthodes immunohistochimiques sont longues, et certains sont limités à travailler avec des organismes modèles et sur les méthodologies complexes. FISH qui cible les espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule est un moi relativement facile et rapidethode pour étudier la localisation spatio-temporelle des gènes et à des fins diagnostiques. Cette méthode peut être robuste et relativement facile à mettre en œuvre lorsque les protocoles emploient court hybridation, les sondes commercialement achetés, qui ne sont pas chers. Ceci est particulièrement robuste lorsque la préparation des échantillons, la fixation, l'hybridation, et la visualisation microscopique ne comportent pas d'étapes complexes. Nous décrivons ici un protocole de localisation de bactéries et de virus dans les tissus d'insectes et de plantes. La méthode est basée sur une préparation simple, la fixation et l'hybridation des supports entiers insectes et les organes disséqués ou sections de plantes fabriqués à la main, avec 20 paires de bases des sondes d'ADN courts conjugués à des colorants fluorescents sur leur extrémité 5 'ou 3'. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus d'insectes et de plantes, et peut être utilisée pour analyser l'expression des ARNm ou d'autres espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule.
Introduction
Lors de l'étude des interactions entre les virus de plantes et d'autres agents pathogènes avec leurs hôtes végétaux infectés, il est important de visualiser les agents pathogènes et leurs acides nucléiques respectifs in situ, indépendamment du fait qu'ils ont des effets négatifs sur leurs hôtes. Ceci est très important lorsque l'on étudie le mouvement de l'agent pathogène à l'intérieur et entre les cellules de la plante. En localisation in situ de produits du gène de l'agent pathogène est une étape essentielle qui s'ajoute à d'autres approches pour l'étude du processus de pathogénicité. De nombreux agents pathogènes des plantes, en particulier les virus, sont transmis par les insectes, comprenant des interactions complexes et intimes avec leurs vecteurs. La localisation de ces virus dans leurs vecteurs est important pour l'étude de la voie de transmission, et les sites possibles d'interaction à l'intérieur du vecteur. La transmission de certains virus de plantes contre les insectes vectorisé est aidée par des bactéries symbiotiques qui se trouvent dans ces insectes. Pour mieux étudier la transmission de ces virus de plantes by leurs vecteurs, il est également essentiel de visualiser les bactéries symbiotiques en général, et ceux qui sont impliqués dans la transmission du virus, en particulier. Colocalisation des virus et des bactéries symbiotiques est donc souhaitable pour enquêter sur les relations possibles entre ces organismes dans leur insecte hôte. En dehors de la transmission du virus, les bactéries symbiotiques influencent plusieurs aspects de la biologie des insectes vecteurs, la localisation ainsi spatiale de ces bactéries dans les insectes est d'un grand intérêt et d'importance.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) est le plus important complexe de la maladie virale de la tomate cultivée dans le monde 1-4. TYLCV est un virus limitée au phloème et est exclusivement guidé par l'aleurode Bemisia tabaci 5,6. Un modèle décrivant la translocation de bégomovirus dans leurs vecteurs aleurodes a été proposée 6-9. Deux obstacles spécifiques sont activement croisés pendantment cette transmission circulante: l'intestin moyen / hémolymphe et les obstacles de la glande hémolymphe / salivaires. Ce procédé de transmission est supposé être médiée par des récepteurs qui reconnaissent inconnus la capside du virus. TYLCV est pensé pour traverser B. tabaci intestin moyen de 6,10, et est absorbé à travers le primaire des glandes salivaires 6 avant d'être injecté dans la plante. Dans l'hémolymphe aleurodes, TYLCV interagit avec une protéine GroEL produite par l'insecte secondaire endosymbiotique bactérie Hamiltonella. Cette interaction assure la sécurité du transport de TYLCV dans l'hémolymphe, et la protège contre l'attaque par le système immunitaire des insectes 11. Hamiltonella et Portiera, la endosymbiote primaire aleurodes, sont logés dans bactériocytes, des cellules d'insectes trouvés dans l'hémolymphe et la maison endosymbiotiques bactéries 11. B. tabaci abrite des bactéries symbiotiques supplémentaires, y compris Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, et Fritschch, qui peuvent être localisés à l'intérieur ou à l'extérieur des bactériocytes, et ont des effets divers sur la biologie de l'insecte 12.
Plusieurs rapports ont tenté d'étudier la localisation de TYLCV dans les plantes et les aleurodes en utilisant des protocoles de fastidieuses et coûteuses telles que microscopie électronique à transmission (MET), les anticorps et l'ARN in situ sur la section d'épaisseur microscopique 10,13, une étude récente décrit la localisation des virus de plantes à l'intérieur de leurs hôtes végétaux et vecteur à l'aide d'un protocole simple 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la localisation de TYLCV dans B. tabaci disséqué estomacs et les glandes salivaires, et aux articles préparés à partir de plantes infectées par le TYLCV. Nous décrivons en outre la localisation de Portiera, la endosymbiote primaire de B. tabaci, et ses endosymbiontes secondaires Hamitonella, rickettsies et Arsenophonus. Ce protocole est basé sur l'utilisation de sondes d'ADN courts, quesont marqués par fluorescence sur leur extrémité 5 ', et de s'hybrider spécifiquement à des séquences complémentaires dans les séquences géniques virales ou bactériennes. Le traitement de l'échantillon est relativement facile et le signal obtenu est très spécifique. Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser des virus, des bactéries et d'autres agents pathogènes chez leurs hôtes végétaux, les animaux et les insectes, et peut en outre être utilisé pour localiser l'ARNm dans un tissu donné.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici pour la localisation d'un virus de plante dans son hôte de plante et l'insecte vecteur, et les bactéries symbiotiques dans leur hôte de la mouche blanche spécifique, peut être adapté pour la localisation d'autres virus dans les plantes et, même dans les tissus animaux. En outre, le protocole peut être utilisé pour localiser les bactéries symbiotiques et pathogènes et d'autres microorganismes dans les systèmes de plantes et d'animaux. Les méthodes décrites repose…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le laboratoire Ghanim a été financée par la subvention de recherche no. 908-42.12/2006 de la Fondation germano-israélienne (GIF), accordent pas. IS-4062-07 du-Unis Israël Royaume-Fonds binational de recherche agricole et le développement (BARD), et subvention de recherche no. 884/07 de la Fondation israélienne des sciences (ISF) à MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
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