Floresan<em> In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu> Hibritlemeler (FISH)
Summary
Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.
Abstract
In situ hibridizasyon (FISH) floresan yaygın ökaryotik hücrelerde gen transkript görselleştirme ve bundan başka, virüs ve bakteri enfeksiyonu gibi hücreye diğer bileşenleri görselleştirmek için modifiye edilebilir için kullanılan çeşitli teknikler verilen bir isimdir. Mekansal yerelleştirme ve enfeksiyon sırasında virüs ve bakterilerin görselleştirme farklı uyaranlara tepki olarak böyle mikroarray'ler ve RNAseq olarak ifade profilleme deneyler tamamlayan önemli bir adımdır. Bu maddelerle zamanmekansal enfeksiyonları anlama hücresel bileşenler ile etkileşimi anlamaya yönelik biyolojik deneyler tamamlar. Bu tür raportör gen sistemleri veya immünohistokimyasal yöntemler gibi virüs ve bakterileri görselleştirmek için çeşitli teknikler zaman alıcıdır ve bazı model organizmalar ile çalışmak ve karmaşık yöntemler dahil sınırlıdır. Hücreye RNA ya da DNA türleri hedef FISH nispeten kolay ve hızlı bir benimgenlerin zamanmekansal lokalizasyonu eğitim ve tanı amaçlı ThOD. Bu yöntem sağlam ve protokolleri pahalı değil kısa hibritlenmesini, ticari olarak satın sondalar, istihdam zaman uygulanması nispeten kolay olabilir. Örnek hazırlama, tespit, melezleme ve mikroskopik görüntüleme karmaşık adımlar içermeyen bu özellikle sağlamdır. Burada böcek ve bitki dokularında bakteri ve virüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu yöntem, 5 'ya da 3' floresan boyalar konjüge kısa DNA probları uçları 20 baz çifti ile basit bir hazırlama, tespit ve böcek bütün bağlar ve kesilen organlarda veya el yapımı bitki bölümlerinin hibridizasyona dayanır. Bu protokol, başarılı bir şekilde böcek ve bitki dokularının, bir dizi tatbik edilmiştir ve hücrede mRNA veya başka RNA veya DNA türleri ifadesini analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Onların hastalıklı bitki barındıran bitki virüs ve diğer patojenleri arasındaki etkileşimleri inceleyerek, bu onların bilgisayarlar üzerinde olumsuz etkilere neden bakılmaksızın, in situ patojenleri ve kendi nükleik asitleri görselleştirmek için önemlidir. Bitki hücreleri içinde ve arasında patojen hareketini incelemek bu çok önemlidir. Patojenin gen ürünlerinin yerinde Yerleştirmede patojenite sürecini incelemek için diğer yaklaşımları tamamlamaktadır önemli bir adımdır. Birçok bitki patojenleri, özellikle virüsler, kendi vektörleri ile karmaşık ve samimi etkileşimleri olan, böcekler tarafından iletilir. Kendi vektörlerde bu virüslerin lokalizasyonu iletim yolunu incelemek için önemlidir ve vektör içinde olası etkileşim siteleri. Bazı böcek-vectored bitki virüsleri iletim bu böceklerin içinde ikamet endosimbiyotik bakteriler tarafından destekli. Iyi bu bitki virüsleri b iletim incelemek içinbunların vektörleri, genel olarak endosimbiyotik bakteriler görsel ve özellikle virüs aktarımı dahil olanlar, için de gereklidir y. Virüs ve endosimbiyotik bakteriler yardımcı sınırlama böylece böcek ev sahibi olan bu organizmalar arasındaki olası ilişkileri araştırmak için arzu edilir. Kenara virüs iletim, endosimbiyotik bakteri böcek vektörlerin biyolojinin çeşitli yönlerini etkileyen, böceklere olan bu bakterilerin, böylece mekansal lokalizasyonu yüksek ilgi ve önem taşımaktadır.
Domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV) (Begomovirüs, Geminiviridae), tüm dünyada yetiştirilen 1-4 domates en önemli viral bir hastalıktır karmaşıktır. TYLCV floem sınırlı bir virüs olduğunu ve sadece beyaz sinek Bemisia tabaci 5,6 ile vectored edilir. Onların beyaz sinek vektörlerinde begomovirüslerinden translokasyon açıklayan bir model 6-9 önerilmiştir. İki özel bariyerler aktif dur kesilmişlerdirmidgut / hemolenfi ve hemolenfi / tükürük bezi bariyerler: Bu circulative iletimini ing. Bu iletim işlemi virüs kapsidine kabul bilinmeyen alıcıları tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. TYLCV B. çapraz düşünülmektedir Bu bitki içine enjekte edilmeden önce orta bağırsak tabaci 6,10 ve birincil salya bezi 6 boyunca emilir. Beyaz sinek hemolimf ise, TYLCV böcek ikinci endosimbiyotik Hamiltonella bakteri tarafından üretilen bir proteinin GroEL ile etkileşime girer. Bu etkileşim hemolimfteki TYLCV güvenli taşıma sağlayan ve böcek bağışıklık sistemi 11. Hamiltonella ve Portiera birincil endosymbiont tarafından saldırılara karşı korur beyaz sinek, bacteriocytes yerleştirilmiştir, hemolenfi ve ev endosimbiyotik bakteriler 11. B. bulunan böcek hücreleri tabaci Rickettsia'lara, Arsenophonus, Wolbachia ve Fritsch gibi ek endosimbiyotik bakteri barındırırbacteriocytes içinde veya dışında lokalize edilebilir ve adet, böceğin biyolojisi 12 farklı etkileri vardır.
Çeşitli raporlar mikroskobik kalın bölümünde 10,13 üzerinde yerinde böyle Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), antikorlar ve RNA gibi zaman alıcı ve masraflı protokolleri kullanarak bitki ve limonluk içinde TYLCV yerelleştirme çalışması için çalıştılar, yeni bir çalışma lokalizasyonu tarif basit bir protokol 14 ile kendi tesis ve vektör konak içindeki bitki virüsleri. Burada B. TYLCV lokalizasyonu için basit bir protokol açıklar tabaci midguts ve tükürük bezleri disseke ve bölümlerde TYLCV-enfekte bitkilerden hazırladı. Biz daha Portiera, B. birincil endosymbiont lokalizasyonunu tarif tabaci ve ikincil endosimbiyontlar Hamitonella, Rickettsia ve Arsenophonus. Bu protokol, kısa DNA sondaları kullanılarak dayalı olduğunufloresan, 5 'ucunda etiketlenmiştir ve özellikle viral ya da bakteriyel gen dizilerinde tamamlayıcı dizilere hibridize edilir. Numune işleme nispeten kolaydır ve elde edilen sinyal çok özeldir. Açıklanan protokol, bunların bitki, hayvan ve böcek ana virüs, bakteri ve diğer patojenleri lokalize etmek için kullanılabilir ve ayrıca herhangi bir dokuda mRNA lokalize etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aynı zamanda bitki ve böcek ev sahibi vektör bir bitki virüsünün lokalizasyonu ve onların özel sineği konukçuda endosimbiyotik bakteriler için burada açıklanan protokol, bitki ve hatta hayvan dokularında diğer virüslerin lokalizasyonu için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol endosimbiyotik ve patojenik bakteri ve bitki ve hayvan sistemlerinin diğer mikroorganizmaları lokalize etmek için de kullanılabilir. Tarif edilen yöntemler, kısa, flüoresan-işaretli oligonükleotid DNA prob ve hücredeki hedef …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ghanim laboratuarda araştırma hiçbir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Alman-İsrail Vakfı (GIF) dan 908-42.12/2006, hiçbir hibe. IS-4062-07 Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (Bard), ve araştırma hibe hayır dan. MG İsrail Bilim Vakfı (ISF) için 884/07
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
