Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных

Клетки микроглии, макрофаги наблюдения паренхимы ЦНС, составляют около 12% от общего клеточной популяции взрослого мозга млекопитающих. Микроглия выводятся из желточного мешка миелоидных клеток-предшественников и различаются по плотности клеток и морфологии в различных cytoarchitectural регионов в взрослой ЦНС ^1-5. В здоровом взрослом мозге, микроглии небольшие, разветвленные или полярные клетки с мелкими, динамических процессов. В отличие от периферической макрофагов морфологии, микроглии продемонстрировать покоя, низкопрофильный фенотип у здоровых мозгов, которые могут появиться как сотовый бездействия, однако в естественных условиях исследования изображений показывают, что микроглии процессы динамически расширить и убрать для контроля за их микросреду таким образом, напоминает " отбор проб и геодезия ^"6,7.

Микроглия высоко и дифференциально реагировать на окружающую среду и патофизиологических изменений в головном мозге, переключениеот Surveillant к государственным обычно рассматривается как их покоя и активированного государств эффекторных соответственно. Этот переключатель в активации может быть опосредованы рецепторами зацепления мембраносвязанных распознавания образов (PRRS), такие как платные-подобных рецепторов (TLR,), которые реагируют на патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMPs), а именно бактериальных и вирусных-производных липопротеинов , нуклеиновые кислоты, углеводы и ^8-11. В дополнение к PAMPs, РРСС, также было показано, чтобы вызвать активации микроглии против стерильных непатогенных молекул, известных как опасность / повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPS), которые представляют собой возмущение в ЦНС гомеостаза, таких как повреждение клеток ^12-16. После включения РРСС инициировать внутриклеточных каскад, который приводит к изменениям в микроглии морфологии клеток и генной экспрессии сигнализации, а именно, активированной микроглии адаптировать фенотип амебоидной-как, перемещать р65 NF-kB субъединицы (P65) в ядро ​​клетки, и активируют произвоводств и секреция провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкин-1 β (IL-1β), наряду с активными формами кислорода (АФК) ^16-24. Хотя интеграл в врожденного иммунного ответа ЦНС, эти выделяемые молекулы также было обнаружено увеличение нейронов окислительный стресс, тем самым вызывая и обостряя нейродегенерацию в пораженных государств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера ^25-29.

Тем не менее, механизмы активации микроглии в патологических состояний полностью не выяснены. Таким образом, изоляция микроглии является мощным исследовательским инструментом в этих биологических процессов, так как многие в естественных особенностей активации микроглии может быть обобщены в культуре. Существует несколько методов для выделения микроглии, в том числе изоляции через градиентом Перколла следующие ферментативного переваривания ткани ЦНС ^30,31. Тем не менее, ферментативное расщепление может изменитьиммунофенотип клеток путем снижения клеточной поверхности антиген выражение ^32, и приводит к снижению выхода клеток на животное, чем методом, описанным в данном документе. В частности, мы сообщаем средний урожай микроглии за щенка коры 7,5 х 10 ⁵ клеток, в то время как ранее сообщалось методы изоляции от всей ЦНС через Перколла градиента доходности 3-5 × 10 ⁵ клеток ^30,33,34. Настоящая процедура обходит использование пищеварения ферментов по изоляции микроглии на основе их свойств низкой приверженности, тем самым сохраняя микроглии иммунофенотип и функциональность.

В настоящем исследовании мы описывают выделение клеток микроглии из смешанных глиальных культурах, полученных из новорожденных гетерозиготных CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP ^{+ / -),} и C57BL / 6 мышей коры через механическим перемешиванием на роторной качалке, расширение ранее опубликовал метод ^24,35. Мы используем бывшего напряжение мыши для легкой визуализации микроглии, какэти мыши выразить GFP под контролем эндогенного локуса CX3CR1 – моноцитов-специфического промотора ^36-38. Этот метод дает очень чистые микроглии культурами в консервированных иммунофенотипа исключая виво, как показано на морфологических изменений, ядерной транслокации р65 и секреции TNF-α, когда вызов с бактериальным липополисахаридом (ЛПС) или Pam ₃ CSK _4, TLR4 и TLR1 / 2 агонистов , соответственно.