عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة
Summary
مفتاح واحد لتحقيق النجاح في البيولوجيا دبقية هو الحفاظ على immunofunction دبقية فيفو السابقين خلال العزلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية وفقا لتقييم immunofunctional التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة ELISA التالية مع عديد السكاريد الشحمي المحفزات proinflammatory (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام).
Abstract
عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة CNS هو أداة قوية التحقيق تستخدم لدراسة البيولوجيا دبقية فيفو السابقين. تفاصيل هذا الأسلوب إجراء لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من القشور الفئران حديثي الولادة عن طريق الانفعالات الميكانيكية مع شاكر دوارة. هذه العزلة الخلايا الدبقية الصغيرة غلة طريقة الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية نقية للغاية التي تظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية يدل على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة في ظروف طبيعية nonpathological في الجسم الحي. كما يحفظ هذا الإجراء نمط ظاهري مناعي دبقية وظائف البيوكيميائية كما يتبين من استقراء التغيرات المورفولوجية، إزفاء النووية من الوحيدات P65 من NF كيلوبايت (P65)، وإفراز خلوى proinflammatory السمة المميزة، عامل نخر الورم-α (TNF-α )، بناء على عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام) التحديات. وبالتالي فإن إجراء العزل الحاضر يحافظ على نمط ظاهري مناعي من كلا هادئة وموارد الوراثية الحيوانيةالخلايا الدبقية الصغيرة vated، وتوفير المنهج التجريبي من التحقيق البيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في فيفو السابقين الظروف.
Introduction
خلايا دبقية، الضامة مراقبة لحمة الجهاز العصبي المركزي، تشكل حوالي 12٪ من السكان الخلية الكلي للدماغ الثدييات الكبار. وتستمد الخلايا الدبقية الصغيرة من الكيس المحي النخاعي السلائف الخلايا وتختلف في كثافة الخلايا والتشكل في مناطق مختلفة داخل cytoarchitectural الكبار CNS 1-5. في البالغين الأصحاء الدماغ، الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا صغيرة، أو القطبية متشعبة مع العمليات الحيوية غرامة. وعلى النقيض من الطرفية التشكل بلعم، يبرهن على وجود الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة، النمط الظاهري الأضواء في أدمغة الصحية التي قد تظهر الخمول الخلوية، ولكن التظاهر في الدراسات المجراة أن عمليات التصوير دبقية تمديد حيوي وسحب لمراقبة المكروية بهم بطريقة تذكرنا " أخذ العينات والمسح "6،7.
الخلايا الدبقية الصغيرة هي غاية وبشكل مختلف تستجيب لتغيرات البيئية والفيزيولوجية المرضية في الدماغ، والتحولمن surveillant إلى الدول تعتبر يستريح وتنشيط عادة الدولة المستجيب، على التوالي. هذا التبديل في تنشيط يمكن بوساطة إشراك مستقبلات غشاء محدد والتعرف على نمط (خنازير)، مثل مستقبلات تول مثل (TLRs)، التي تستجيب لأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، وهي البروتينات الدهنية البكتيرية والفيروسية مشتقة والأحماض النووية، والكربوهيدرات 8-11. بالإضافة إلى PAMPs، وأيضا ثبت خنازير للحث على تفعيل دبقية ضد العقيمة، والجزيئات غير إمراضية المعروفة باسم أنماط الجزيئية الخطر / الضرر المصاحب (DAMPs)، والتي تمثل اضطراب في الجهاز العصبي المركزي التوازن، مثل تلف الخلايا 12-16. مرة واحدة تعمل، خنازير الشروع في داخل الخلايا مما يشير إلى أن النتائج في سلسلة تغييرات في التشكل دبقية الخلية والجينات التعبير، على وجه التحديد، الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط التكيف مع النمط الظاهري مثل أميبية، ونقل من P65 NF كيلوبايت الوحيدات (P65) إلى نواة الخلية، وupregulate و الم Ùكشن وإفراز السيتوكينات proinflammatory، مثل عامل نخر الورم-α (TNF-α)، انترلوكين 1 β (IL-1β)، جنبا إلى جنب مع أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 16-24. على الرغم من أن يتجزأ في الاستجابة المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي، كما تم العثور على هذه الجزيئات يفرز لزيادة الاكسدة العصبية، مما يحفز وتفاقم تنكس عصبي في الدول المريضة مثل الشلل الرعاش ومرض الزهايمر 25-29.
ومع ذلك، لا يفهم تماما آليات تفعيل دبقية في الحالات المرضية. لذلك، عزل الخلايا الدبقية الصغيرة هو أداة قوية التحقيق في هذه العمليات البيولوجية، والعديد من الميزات في الجسم الحي من تفعيل دبقية يمكن تلخيصها في الثقافة. العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك العزلة عن طريق التدرج Percoll التالية الهضم الأنزيمي من الأنسجة CNS 30،31. ومع ذلك، يمكن تغيير الهضم الأنزيميعلى نمط ظاهري مناعي للخلايا عن طريق الحد من سطح الخلية مستضد التعبير 32، والنتائج في انخفاض العائد خلية لكل حيوان من الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة. على وجه التحديد، ونحن التقرير متوسط العائد الخلايا الدبقية الصغيرة في القشرة الجرو من 7.5 × 10 5 خلايا، في حين ذكرت سابقا أساليب بمعزل عن كامل الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدرج العائد Percoll 3-5 × 10 5 خلايا 30،33،34. تلتف الإجراء الحاضر استخدام إنزيمات الهضم من خلال عزل الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى خصائص المنخفض تمسكهم، وبالتالي الحفاظ على نمط ظاهري مناعي دبقية وظيفة.
في هذه الدراسة، ونحن تصف عزل خلايا دبقية من ثقافات مختلطة الدبقية مشتقة من حديثي الولادة متخالف CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -)، وC57BL / 6 قشرات الفئران عن طريق التحريض على شاكر الميكانيكية الدوارة، امتدادا من السابق طريقة نشر 24،35. نحن الاستفادة من سلالة الماوس السابق لتصور سهل من الخلايا الدبقية الصغيرة، وهذه الفئران التعبير عن GFP تحت سيطرة CX3CR1 موضع الذاتية – مروج الوحيدات محددة 36-38. وتنتج هذه الطريقة الثقافات دبقية نقية للغاية مع الحفاظ على نمط ظاهري مناعي فيفو السابقين كما يتضح من تغيرات شكلية، إزفاء النووية من P65، وإفراز TNF-α عندما تحدى مع عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) أو بام 3 CSK 4، TLR4 وTLR1 / 2 منبهات ، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر الإجراء الحالي وسيلة فعالة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من الفئران حديثي الولادة. هذا الإجراء له فائدة شقين من 1) الحفاظ على نمط ظاهري مناعي الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة، على النحو الذي يحدده التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وإليسا، و، 2) ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل معهد علوم الصحة البيئية R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
