ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、アポリポタンパク質C-IIIのノックアウトウサギの生産

全ての動物の保守、管理および使用手順は、ミシガン大学の動物の使用およびケアに見直し、大学委員会によって承認された。 1。 ZFN設計·選定メーカーに目的の遺伝子（ 例えばウサギアポCIII）のゲノム配列情報を提供する。 ZFNスコアに基づいて実験のために、ZFNセット（複数可）を選択します。 2。ウサギの胚コレクション過剰排卵は性的（6〜18ヶ月）成熟したニュージーランドホワイト（NZW）最初の2回の注射、次の2回の注射と6mgのための5 mgのための3ミリグラムの投与量とFSHの皮下（SC）注射回/日による雌ウサギ最後の2回の注射のための。 排卵を誘発する最初のFSHの注射後72時間で200 IU hCGの単回静脈内（iv）注射を管理します。すぐにhCG注射後の雄のウサギの過排卵メスメイト。 EuthaniZEペントバルビタールナトリウムで過剰排卵ドナーウサギ（1​​50 mg / kgを、IV）を16〜18時間後に受精（PSI）で。 慎重に全体の卵管と卵巣の構造を収集することにより、卵管膨大部を回復。 HEPES 10mlの操作培地で各卵管をフラッシュ子宮卵管の端部から媒体を注入することにより、10％ウシ胎児血清を補充したTCM 199緩衝。ペトリ皿に卵管卵巣端開口部にフラッシュされたメディアを収集します。 観察して、フラッシュされた培地中で回収された胚を特定の操作媒体に胚を3回洗って、空気中に38.5℃で操作媒体に保管し、受精の発生を実体顕微鏡下でそれらを観察します。前核期胚に微量注入の準備を19〜21時間PSI 3。 ZFN mRNAの準備 RNA分解酵素を含まない0.1×TE（1 mMのトリス-Cl、pHの再懸濁の前に得られたmRNAを精製pH8.0、0.1mMのEDTA）。濃度を測定し、使用するまで-80℃でmRNAを格納します。 ZFNペアをコードするmRNAを準備します（4-10 NG / pH7.5で1のトリス-Clで、0.1 mMのEDTA中μL）、10μLバイアルにアリコート。使用直前まで-80ºCで保存します。マイクロインジェクションの前に、RNAのバイアル（複数可）を解凍し、氷上で保管してください。 4。胚のマイクロインジェクション削除メディア室を持っている1ウェルチャンバースライド上で操作媒体の5μlのドロップを配置することによって、マイクロインジェクションプラットフォームを準備します。加熱された顕微鏡のステージ上のミネラルオイルと場所と中程度の廃棄をカバーしています。 マイクロマニピュレータのホルダアームに保持ピペット（120μmの直径）を配置し、操作媒体の低下にそれを配置します。 マイクロピペットプラー装置にホウケイ酸ガラス毛細管を加熱し、引っ張​​ることにより注射マイクロピペットを作製する。インジェクションピペットで注入されるmRNAをロードします。 マイクロインジェクターに接続された圧縮空気供給をオンにします。 、インジェクションホルダーにインジェクションピペットを置くマイクロマニピュレータの上に置くと操作媒体の低下にそれを配置します。 次の提案したパラメータで設定マイクロインジェクター、：holdP = 2 PSI、InjP = 20 PSI、1-5 PLの注入量になりますCLEARP = 60 PSI、Injtime = 1秒、。 静かにホールディングピペットに対してそれをタップすることで、注入ピペットの先端を開きます。 プラットフォーム上のマイクロマニピュレーション降下胚（30〜50）を転送。胚をキャプチャし、注射針、胚およびx軸に沿って保持ピペットを整列させるためにホールディングピペットを使用する。 400X倍率下では、胚を通じてインジェクションピペットを進める。核を避けるように注意してください。原形質膜が穿孔されると、プレスフットペダルを注入する。注射後、針を撤回、胚をリリース。残りのすべてのEMのためのプロセスを繰り返しbryos。 非必須アミノ酸（NEAA）、必須アミノ酸（EAA）、1mMのL-グルタミン、0.4mMのピルビン酸ナトリウム、および10％を補充したアールの平衡塩類溶液（EBSS）からなる胚培養培地中に注入した胚を3回洗浄FBS。 これらは外科的に（ステップ5.1を参照）同期化されたレシピエント雌NZWウサギの卵管に移される前に、1〜2時間、空気中のCO 2 5％で38.5℃で胚を培養する。代わりに、彼らはin vitroでの検証やアッセイのために使用される前に、彼らは胚盤胞期に到達するまでの文化胚を。 5。胚移植約計量、良好な健康状態にある5月12日カ月の雌のNZWウサギを選択します。レシピエント動物として4.0〜5.0キロ。ゴナドトロピン（ステップ2.2参照）ドナー動物（複数可）にhCG注射のそれと同じ時点で受信者にホルモン（GnRH）注射は筋肉内（IM、50 MCG / mlの、0.3ミリリットル/動物）を放出管理。 </李> マイクロインジェクションが完了した後、胚移植（GnRH投与後、通常は16〜24時間）の受信者のウサギを準備します。 10〜40 mg / kgのケタミン（IM）をウサギに麻酔および/または吸入によってイソフルラン（2-4％）を気化。無菌眼軟膏を適用することにより、過度の乾燥からウサギの目を保護します。それはつまり 、完全に意識不明になるまで動物を観察します。フットパッドは、十分な麻酔の表示であるペダル反射の欠如を確認するために使用されている絞り、ペダル反射神経に応答しません。 ウサギの腹部を剃り、消毒スクラブで洗浄、消毒液が続き、滅菌ガーゼスポンジで剃毛面積を拭く。 無菌条件下で手術を行う手術を通じて受信者のウサギごとに約15分のバイタルサインを記録する。 胚の利用可能な数に応じて、1レシピエント動物へ10月25日の胚を転送します。 の終了時外科的手法は、コーティングされた吸収性縫合糸で筋肉層を閉じます。吸収性縫合糸を使用した表皮下縫合のいずれかで、またはnonabsorable縫合糸（ 例えば単繊維ナイロンまたは類似）を使用して簡単な中断皮膚縫合糸で皮膚を縫合。 動物を暖かく保つとその胸骨横臥が達成されるまで、それを監視する。 毎日動物を監視します。動物の世話をするために獣医師の指示に従ってください。痛みを和らげる、および/または獣医によって必要と判断した場合、発熱、毎日POST操作を減らすために、メロキシカム（SC 1.0 mg / kgの）を管理。 約10〜14日後に動作時nonabsorable皮膚縫合糸を取り除く。 6。 ZFN誘導される遺伝子破壊の検出 in vitroでの検証のために、in vitroで培養した胚に遺伝子型判定を行う。 5μlのNP40溶液（1％NP40プラス1 UG / mlののTaqバッファー中のプロテイナーゼKで桑実胚/胚盤胞の段階に開発された溶解、個々の胚）55℃で0.5〜1時間、および95℃で10分間子孫の遺伝子型判定のために、新生児のキットから耳の皮膚サンプルを収集したゲノムDNAを抽出し、PCR配列決定のためのテンプレートとしてそれらを使用しています。出血を止めると不快感を軽減するために収集した後にサンプリング領域にクイック·ストップを適用します。 LA-TaqおよびZFN標的部位の上流に位置する（5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 '）及び（5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC -3下流'）されるPCRプライマー対を用いてPCRのための鋳型として工程6.2または6.3からの溶菌を使用。 PCR産物を精製し、配列決定プライマー（5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 '）でそれらを配列。 標的部位周辺のシーケンス図中の二重線を探すことにより、変異体のサンプルを特定します。 「陽性」として、二重曲線を有するものにラベルを付けます。 、TAクローニングベクターに「正」のPCR産物をクローン10から20個のクローンをピックアップし、シーケンスの挿入、およびTを中心に変異を確認argetingサイト。