Производство аполипопротеина C-III Knockout Кролики использованием цинковый палец нуклеаз
Summary
Последние события в генного таргетинга инструментов делает производство нокаутом (KO) кролики возможно. В настоящей работе, мы получили пять аполипопротеина (Апо) C-III KO кроликов, используя цинковый палец нуклеаз (ZFN). Эта работа показала, что ZFN является весьма эффективным методом для получения KO кроликов.
Abstract
Аполипопротеина (Apo) C-III (ApoCIII) находится на поверхности плазменного хиломикронов (СМ), очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов высокой плотности (HDL). Было признано, что высокие уровни плазмы ApoCIII фактор риска constitutea для сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Повышение уровня плазмы ApoCIII часто коррелирует с резистентностью к инсулину, ожирения и гипертриглицеридемии. Неоценимая знания о роли ApoCIIIin липидов и сердечно-сосудистых заболеваний метаболизма, была получена из трансгенных мышиных моделей, включая ApoCIII нокаутом (KO) мышей, однако, следует отметить, что метаболизм липопротеинов у мышей отличается от людей во многих аспектах. Это не известно до сих пор ли повышен в плазме ApoCIII прямо атерогенными. Мы работали для разработки ApoCIII KO кроликов в настоящем исследовании, основанной на гипотезе, что кролики могут служить reasonablemodelfor изучения человеческого метаболизма липидов и атеросклероз. Цинк палец нуклеазы (ZFN) Наборы ориентации кролик АрoCIIIgene были подвергнуты проверке в пробирке эмбриона до микроинъекции. МРНК вводили в цитоплазму 35 кроликов пронуклеусов эмбрионов на стадии, и оценили частота мутаций у государства бластоцисты. Из шестнадцати бластоцисты, что были проанализированы, удовлетворительная скорость мутации 50% (8/16) по поводу ударов сайте был достигнут, поддерживая использование набора 1 для естественных условиях экспериментов в. Далее, мы микроинъецировали 145 эмбрионов с Set 1 мРНК, и передал эти эмбрионы до 7 кроликов получателей. После 30 дней беременности, 21 комплектов родились, из которых пять были подтверждены как ApoCIII KO кроликов после ПЦР секвенирования анализов. Скорость животных КО (# KO комплекты / общее родился) составила 23,8%. Общая эффективность производства составляет 3,4% (5 kits/145 эмбрионов). Настоящая работа показала, что ZFN является весьма эффективным методом для получения KO кроликов. Эти ApoCIII KO кролики являются новыми ресурсы для изучения роли ApoCIII в липидных метаболизма.
Introduction
Аполипопротеина (Apo) C-III (ApoCIII) представляет собой небольшую O-гликозилированный секреторный белок, который синтезируется главным образом в печени и кишечнике. Он находится на поверхности плазменного хиломикронов (СМ), очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов высокой плотности (HDL). ApoCIII была признана как фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний 1. Пациенты с наследственным дефицитом ApoCIII имеют низкую триглицеридов в плазме (ТГ) уровней и снижение субклинический атеросклероз коронарной артерии 2,3. Повышенные уровень в плазме ApoCIII, с другой стороны, часто коррелирует с резистентностью к инсулину, ожирение и гипертриглицеридемии (HTG) 4,5.
Джин нокаутом (КО) является мощным средством для изучения функции гена. В соответствии с наблюдениями в мутантных популяций человека, нокаут гена ApoCIII у мышей привело к снижению ТГ в плазме и защиты от приема пищи ГТГ 6. Появились Такая положительная роль ApoCIIIне зависит от аполипопротеина Е (ApoE), как мыши, дефицитные обоих ApoE и ApoCIII также защищены от приема пищи гиперлипидемии 7. Хотя эти модели ApoCIII KO мыши предоставили ценную информацию о возможных функций ApoCIII у человека, следует отметить, что метаболизм липопротеинов у мышей отличается от людей во многих аспектах. Например, мышь не хватает плазмы холестерил белка-переносчика эфиров (CETP), крупный фермент, участвующий в транспортировке ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП 8. Поэтому, необходимо разработать соответствующую животную модель для более глубокого понимания физиологической роли ApoCIII в естественных условиях.
Кролик является классическим видов животной модели 9-11. Она имеет короткий период беременности (30-31 дней), большой размер помета (4-12/litter) и могут быть размещены удобно в крытый объект. По сравнению с мышами, кролики филогенетически ближе к людям 10. Важно отметить, что, как хучеловек, но в отличие от мышей, кроликов LDL богатых млекопитающие и имеют существенные уровни ПООППО 10,12. Кроме того, они чувствительны к холестерина диеты, богатой вызванной атеросклерозом с поражением аналогичных тем, которые наблюдаются в человеческом атеросклероза 13. По этим причинам, мы предположили, что ApoCIII KO кролики могут служить лучшей модели, чем их коллеги мыши по расследованию роли ApoCIIIplay в метаболизме липидов и атеросклероз у людей.
Производство гена целевой трансгенных (GTT) кроликов был вызов. В основном это связано с отсутствием зародышевой линии, передающей эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), и крайне низкой эффективности соматической клетки переноса ядра (SCNT) у кроликов. ESC является основным инструментом для создания мышей ГЦГ, в то время как и SCNT успешно применяется для создания KO животных в видов хватает зародышевой линии, передающие ESCs, в том числе свиней, овец и крупного рогатого скота, но не кроликов. Недавно цинковый палец нуклеазы (ZFN), Транлия Активатор-Как Эффектор нуклеазы (Talen) 14, и РНК Руководствуясь Эндонуклеаза (RGEN) 15 появился как мощное средство для редактирования генома. Эти нуклеазы, так называемые «молекулярные ножницы», являются эффективными в создании двунитевых разрывов (ДР) в геноме, которые могут привести к функциональной нокаутом гена-мишени или используемые для интеграции последовательность ДНК в определенном локусе генома в ряд видов 16. В 2011 году в числе первых адаптации технологии ZFN, мы получили активатора пролиферации пероксисом рецептор гамма (PPAR-) KO свиные клетки с помощью этого подхода и успешно генерируемых РАПП KO свиней после использования этих клеток в течение SCNT 17. В том же году, сообщалось эффективным разрушение гена иммуноглобулина и целевой замена у кроликов также с использованием ZFN 18.
В настоящем исследовании, пять ApoCIII KO кролики были получены, что подтверждается ПЦР секвенирования с использованием ZFN Set 1 (см. рисунок 1 </sЧонг>. блок-схемы для иллюстрации). Эти животные являются новыми ресурсы для изучения роли ApoCIII в липидных метаболизма.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей работе, пять ApoCIII KO кролики были получены с использованием технологии ZFN. Ранее единственным доклад производства GTT кроликов также использовали технологию ZFN 18. Настоящая работа подтвердила, что ZFN полезно эффективно генов-мишеней в кроликов.
В настоящем исследовании, трансгенный ставка (положительный комплекты / общее родился) is23.8% (5/21), что сопоставимо с аналогичным показателем предшествующей отчета ZFN у кроликов (30,8%, 16/52) 18, и те, сообщил использования ZFN у других видов животных, в том числе зебры рыбы 19 мышей 20, крыс 21 и свиней 17. Этот показатель фактически выше, чем скоростей многих обычных производственных трансгенных кроликов исследований, которые обычно попадают в диапазоне 5-20%. Например, в стремлении к продукции ApoCIII трансгенных кроликов через обычного микроинъекции ДНК, Динг и др.. Получены 3 положительных учредителей из 54 щенков, рожденных (5,6%) 22.
В соответствии с предыдущими выводами, мутации по поводу ударов сайтов являются переменными, в том числе удалений или вставок, состоящих разное количество баз (в пределах от 1-21 в пяти KO кроликов). На основе конкретной информации о последовательности из учредителей животных, он предсказал, что по крайней мере четыре (то есть., Содержащие Δ1, 1, 1, или Δ20 мутации) будет иметь потери функции ApoCIII. Животное Р-16 с Δ21 может отображаться функциональную потерю, как эта мутация, по прогнозам, только привести к потере семи аминокислот, но не сдвиг рамки считывания. В конечном счете, фенотип анализы необходимы для определения, если эти основатель животные действительно показать потерю функций ApoCIII.
Ни один из пяти KO кроликов, полученных в данном исследовании не содержат биаллельных модификации. Интересно, что это также имеет место в предыдущем докладе кролика ZFN. В противоположность этому, когда ZFNs ориентации α1 ,3-галактозилтрансферазу были применены к свиньиКлетки, частота ориентации одну аллель колебалась от 7-46%, при этом около одной трети мутаций, создающих одним шагом биаллельных нокаутом 23. В соответствии с этим, когда Talen был применен к свиньи фибробластов, то биаллельных модификации были найдены в примерно 15-40% от общего объема позитивных клонов 14. Вполне возможно, что неспособность генерировать биаллельных кроликов KO в настоящем исследовании может указывать разницу виду (например, кроликов против свиней) для такой мощностью нуклеазной основе генного таргетинга. Это, однако, более вероятно, что это просто потому, что количество КО кроликов, генерируемых в этом проекте является относительно небольшим. Мы считаем, что ZFN способен генерировать bialleic мутации в кроликов, которые должны быть рассмотрены в качестве еще одного потенциального преимущества, основанного ZFN GTT производстве кролика. Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы подтвердить такую способность ZFN у кроликов.
В заключение, данная работа показывает, что ZНа основе FN генного таргетинга подход эффективен в производстве KO кроликов. В частности, мы получили пять ApoCIII KO кроликов с удовлетворительной скоростью трансгенных 23,8%. Эти животные, как полагают, чтобы обеспечить более существенную информацию о роли этого белка на липидных метаболизма в организме человека, чем соответствующие модели мыши. Мы прогнозируем, основанный ZFN таргетинг гена, а также другие нуклеазам основе таких технологий, как Talen и RGEN, в nonmurine животных значительно облегчит разработку новых моделей на животных для изучения различных человеческих заболеваний.
Рисунок 1. Блок-схема производства нокаутом кроликов с использованием технологии ZFN. Производство KO кроликов с использованием технологии ZFN начинается с выбором интересующего гена. Информация о последовательности обеспечивается, наборы ZFN предназначены, и Subjected дрожжей на основе проверки на месте. В пункте пропуска (СР) 1 (СР-1), только те наборы проходили в доме валидацию (50% или выше внутреннего положительного контроля) будет предоставлена пользователям для выбора. Если нет комплекта не пройти CP-1, дополнительная последовательность могут быть необходимы для разработки эффективных наборов ZFN. Проверка эмбриона в пробирке следует обеспечить выбранный ZFN набор может вызывать мутации на отдельных участках (CP-2). ZFN набор (ы) будет использоваться только тогда, когда она проходит БО-2 (> = 10% ставки мутация эмбрионов в пробирке). Отказ в КП-2 понадобится доработка наборов ZFN. Эмбрион доноры будут подготовлены и пронуклеусов эмбрионов на стадии будет микроинъекции с проверенных массивов ZFN. Эти микроинъекции эмбрионы будут переведены на синхронизированных реципиентов эмбрионов. После периода один месяц беременности, новорожденные будут генотипированы (СР-3). Если ни один из новорожденных не являются положительными, дополнительная микроинъекции будет выполнена. Это займет 2-3 месяца от начала проекта до КП-2, предполагая, по недостаточности во время процесса. Он принимает дополнительные 2-3 месяцев с СР-2 к СР-3. Поэтому можно генерировать нокаутом кролика в 4-6 месячного срока с использованием технологии ZFN. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. ZFN дизайн. Три комплекта ZFN (Set 1, 2 и 3) были разработаны в интересах различных последовательностей на экзоне 1 или экзона 2 кролика ApoCIII (А). Все три комплекта были подвергнуты дрожжей MEL-1 репортерного анализа для определения действия ZFN. Согласно протоколам ми изготовител, ZFNs, которые показывают> 50% деятельности, что внутреннего положительного контроля завода-изготовителя, считаются полезными для в пробирке и в естественных генома экспериментов редактирования.Деятельность ZFN были 224,2% за 1-м сете, 196.9% для серии 2 и 177,8% для Set 3 (В), поэтому указан 1 был выбран в настоящем исследовании. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Экстракорпоральное эмбрион проверка ZFN. МРНК (5 мкг / мл) Сета 1, микроинъекции в цитоплазму 35 пронуклеусов эмбрионов этап кролика (А). Промываемое эмбрионы без микроинъекции лечения (N = 31) были использованы в качестве контрольной группы. Темпы развития BL был 77,4% в контрольной группе. В микроинъецировали группы, скорость BL составила 51,4%. Из 16 БЛ подвергали ПЦР секвенирование, 8 (50%) были идентифицированы как положительные, указывающий Set 1 является эффективным набор ZFN, чтобы вызвать мутации в щитомсайт тин (B, apoc3wt.seq, черно-коробке) из ApoCIII у кроликов. БСТ, содержащие мутации, BL # Apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 и 17 (B, красный подчеркнуты). Остальные НД (# Apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 и 16) не имеют мутации в ориентации на сайты. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Производство ApoCIII KO кроликов. Сто сорок пять эмбрионов микроинъекции с ZFN набор 1 мРНК были переданы 7 псевдо-беременности кроликов получателей (А). Свежий промываются эмбрионы (N = 75) без ZFN микроинъекции были переданы получателям (N = 6) в качестве контрольной группы. Термин ставка рассчитывается как общий термин комплекты / всего эмбрионов в эксперименте группы 140,5% (21/145), тогда как стоимость 29,3% (22/75) в контрольной группе (А). Из 21 комплектов, рожденных в микроинъекции группы, пять (R1, R9, R11, R12 и R16) были идентифицированы как положительные наборы KO после ПЦР последовательности (B). В индели по поводу ударов сайте включают две вставки (1 как для R9 и R11) и три делеции (Δ1, Δ 20, Δ 21 для R1, R12 и R16, соответственно). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично финансировалось за счет грантов от Национального института здоровья (HL105114, HL088391, NS066652 и HL068878 чтобы YEC), Американской ассоциации сердца (Национальный научный развития 0835237N для JZ). YEC при финансовой поддержке как наделенного Фредерик Huetwell профессор сердечно-сосудистой медицины при Университете Мичигана медицинский центр (УГМК). Эта работа используется Core Services, поддерживаемые Центр перспективных моделей для поступательного наук и терапии (CAMTraST) в УГМК.
Materials
| APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
| mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
| MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
| Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
| Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
| Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
| MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
| BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
| Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
| HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
| Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
| Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
| Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
| Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
| Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
| Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |
References
- Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
- Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
- Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
- Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
- Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
- Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
- Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
- James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
- Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
- Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
- Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
- Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
- Petersen, B. Update on ‘molecular scissors’ for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
- Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
- Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045 (2011).
- Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
- Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
- Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870 (2010).
- Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
- Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).
