In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello
Summary
Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.
Abstract
La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione.
In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l'elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.
Introduction
Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell'ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello 4-6.
La zona subventricolare (SVZ) ha recentemente emerso come una nicchia neurogena cruciale. Neuroblasti SVZ-derivati migrano verso il bulbo olfattivo (OB) attraverso il flusso migratorio rostrale (RMS), rendendo questo il processo di migrazione più lunga del 1,7,8 cervello postnatale. Il / RMS / sistema OB mammiferi SVZ è diventato unmodello utile per studiare varie fasi neurogenesi, quali la proliferazione, migrazione e differenziazione 1,8. Molti fattori di crescita e segnali extracellulari regolano la neurogenesi SVZ e la migrazione lungo le RMS, ma i meccanismi molecolari intracellulari sono ben lungi dall'essere pienamente compreso 1,9. La corretta migrazione lungo le RMS è di fondamentale importanza per la successiva maturazione dei neuroni neonati 10. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che neuroblasts SVZ-derivate possono uscire dalle RMS a siti lesioni cerebrali 4-6,11-13. Così, indagando la migrazione neuroblasti meccanismi di segnalazione di regolazione è fondamentale non solo per capire neurogenesi, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per etichettare progenitori neurali SVZ da elettroporazione in vivo postnatale e monitorare la loro migrazione lungo le RMS culture acuti fetta cervello usando time-lapse confocale disco rotante microscopy. L'elettroporazione è ampiamente usato in studi sullo sviluppo embrionale da a stadi adulti 14-18. Si tratta di un potente strumento per indirizzare e manipolare progenitori neurali SVZ e rappresenta un'alternativa più economica e molto più veloce di iniezione stereotassica di vettori virali o generazione di modelli transgenici 1,15,19,20. Si tratta di una procedura relativamente semplice che non richiede l'intervento chirurgico e ha alti tassi di sopravvivenza. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprimono plasmidi in modelli genetici di topo che impiegano il sistema loxP può essere utilizzato per indirizzare i geni di interesse o per ottenere l'etichettatura permanente dei progenitori SVZ, rappresentando così uno strumento utile per gli studi di neurogenesi adulta 21,22.
Imaging RMS migrazione neuroblasti nel cervello intatto è ancora difficile a causa di limitazioni tecniche. Tuttavia, questo processo può essere monitorato tramite disco confocale spinning time-lapse microscopia di fette di cervello acuto, che forniscono un adeguato system molto simili alla condizione in vivo anche suscettibili di manipolazione farmacologica 23,24. Accoppiamento elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse imaging faciliterà la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppo di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l'OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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