В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики
Summary
Нейробласта миграция является одним из основных событий в послеродовой нейрогенеза. Мы опишем протокол для эффективной маркировки нейробластах по в естественных условиях послеродового электропорации и последующей визуализации их миграции с использованием покадровой визуализации острых срезах мозга. Мы включать описание для количественного анализа динамики нейробластов Отслеживая видео.
Abstract
Субвентрикулярной зоне (СВЗ) является одним из основных нейрогенных ниш в послеродовой мозга. Здесь, нейронные клетки-предшественники размножаться и приводить к нейробластах, способных двигаться по ростральной миграционного потока (RMS) к обонятельной луковице (OB). Это междугородной миграции требуется для последующего созревания новорожденных нейронов в OB, но молекулярные механизмы, регулирующие этот процесс пока не ясны. Исследуя сигнальных путей, контролирующих нейробластов моторику может помочь не только понять фундаментальную шаг в нейрогенеза, но также имеют терапевтический регенеративный потенциал, учитывая способность этих нейробластах таргетинг на сайты мозга, пострадавших от травмы, инсульта или дегенерации.
В этой рукописи мы описываем подробный протокол для в естественных условиях послеродового электропорации и последующей покадровой визуализации нейробласта миграции в RMS мыши. Послеродовая электропорации может эффективно трансфекции СВЗ прародителяклетки, которые в свою очередь генерируют нейробласты мигрирующих вдоль RMS. Использование конфокальной вращающийся диск покадровой микроскопии на острых культур мозга срезов, нейробластов миграции можно наблюдать в среде тесно напоминающие состояние в естественных условиях. Кроме того, нейробластов моторики могут быть отслежены и количественному анализу. В качестве примера, мы опишем, как использовать в естественных условиях послеродовой электропорации в GFP-экспрессирующих плазмиды маркировать и визуализировать нейробласты мигрирующих вдоль RMS. Электропорации из shRNA или CRE рекомбинантному-экспрессирующих плазмид в условных нокаутных мышей, использующих систему LoxP также могут быть использованы для генов-мишеней, представляющих интерес. Фармакологические манипуляции острых культур мозга срез может быть выполнена исследовать роль различных сигнальных молекул в нейробласта миграции. Объединяя в естественных условиях электропорации с покадровой обработки изображений, мы надеемся понять молекулярные механизмы, контролирующие нейробластов моторику и способствовать разработкения новых подходов в целях содействия ремонт мозга.
Introduction
В мозге млекопитающих, генерация новых нейронов (нейрогенез) происходит после рождения в основном в двух регионах, субвентрикулярной зоне (СВЗ) из боковых желудочков и под зернистым зоне в зубчатой извилине гиппокампа 1. Значительное доказательства, собранные в последние годы поддерживает важнейшую роль в послеродовой нейрогенеза в гиппокампе и обонятельной функции памяти лампа 1-3. Важно отметить, что послеродовая нейрогенез также имеет терапевтический потенциал из-за его отношений с дегенеративными неврологическими расстройствами, и способность нейробластах мигрировать в пострадавших сайтов в мозге 4-6.
Субвентрикулярной зоне (СВЗ) недавно стала важнейшим нейрогенной нише. СВЗ-производные нейробласты мигрируют к обонятельной луковице (OB) через ростральной миграционного потока (RMS), что делает этот самый длинный процесс миграции в послеродовом 1,7,8 мозга. Млекопитающих СВЗ / RMS / система О.Б. сталполезная модель для изучения различных шагов в нейрогенеза, такие как пролиферации, миграции и дифференцировки 1,8. Многие факторы роста и внеклеточных сигналы регулируют СВЗ нейрогенеза и миграции вдоль RMS, но внутриклеточные молекулярные механизмы далеки от полного понимания 1,9. Правильное миграции вдоль RMS имеет решающее значение для последующего созревания новорожденных нейронов 10. Кроме того, некоторые исследования показали, что СВЗ-производные нейробласты могут мигрировать из RMS для ушиба мозга сайтов 4-6,11-13. Таким образом, исследуя механизмы сигнализации регулирующее нейробластов миграции является фундаментальным не только понять нейрогенез, но и для потенциальных терапевтических применений.
Здесь мы описываем подробный протокол маркировать СВЗ нервные клетки-предшественники по в естественных послеродовой электропорации и контроля за их миграции вдоль RMS при острых культур мозга срезов с помощью покадровой вращающийся диск конфокальной microscoру. Электропорацию широко используется в исследованиях развития от эмбриональных до взрослой стадии 14-18. Это мощный инструмент для выявления и манипулировать СВЗ нервные клетки-предшественники и представляет собой более дешевую и значительно быстрее альтернативу стереотаксической инъекции вирусных векторов или поколения трансгенных моделей 1,15,19,20. Это относительно простая процедура, которая не нуждается в операции и имеет высокие показатели выживаемости. Электропорация shRNA или CRE рекомбиназу экспрессирующих плазмид в мыши генетических моделей, использующих систему LoxP могут быть использованы для генов-мишеней, представляющих интерес или для достижения постоянного маркировки СВЗ предшественников, тем самым представляя собой полезный инструмент для нейрогенез исследований 21,22.
Изображений RMS нейробластов миграция в интактном мозге по-прежнему сталкивается с проблемами из-за текущих технических ограничений. Тем не менее, этот процесс можно контролировать с помощью конфокальной вращающийся диск покадровой микроскопии острых срезах мозга, которые обеспечивают подходящую систэм напоминающий состояние в естественных условиях также позволяет использовать их для фармакологической манипуляции 23,24. Муфта в естественных условиях послеродового электропорации с покадровой обработки изображений будет способствовать понимание молекулярных механизмов, контролирующих нейробластов моторику и способствовать развитию новых подходов в целях содействия ремонт мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективное миграция нервных клеток-предшественников вдоль RMS обеспечивает их последующее созревание в функциональные нейроны 10. Видные потоки нервных клеток-предшественников, направленные на ОВ могут видеть в человеческой младенчестве и, вероятно, играют важную роль в раннем …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
МС и YZ поддерживаются KCL и KCL-китайских аспирантов studentships. МО финансировалось за счет биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета PhD студенчества. Мы благодарим Масару Okabe и Дзюнъити Миядзаки для плазмиды PCX-EGFP и Алена Chedotal и Athena Ипсиланти за ценные советы по электропорации.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
