Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme
Summary
Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.
Abstract
Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyindeki ana nörojenik niş biridir. Burada, sinir atalarıdır çoğalır ve koku ampul (OB) doğru rostral göçmen akışı (RMS) birlikte hareket edebilmek nöroblast doğuran. Bu uzun mesafe göç OB yenidoğan nöronların sonraki olgunlaşması için gereklidir, fakat bu süreci düzenleyen moleküler mekanizmalar hala belirsiz olmasıdır. Neuroblast hareketliliğini kontrol sinyal yollarını araştıran nörojenezindeki temel bir adım anlamak değil, aynı zamanda yaralanma, inme veya dejenerasyon etkilenen beyin sitelerini hedeflemek için bu neuroblasts yeteneği verilmiş, tedavi rejeneratif potansiyele sahip olabilir sadece.
Bu yazıda; in vivo sonrası elektroporasyon ve fare RMS neuroblast göç sonraki zaman atlamalı görüntüleme için ayrıntılı bir protokol açıklar. Doğum sonrası elektroporasyon verimli SVZ'una dede transfect olabilirsırayla RMS boyunca göç neuroblasts oluşturmak hücreleri. Akut beyin dilim kültürleri disk time-lapse mikroskopi iplik konfokal kullanarak, neuroblast göç yakından in vivo durumu andıran bir ortamda izlenebilir. Ayrıca, neuroblast hareketliliği izlenen ve kantitatif analiz edilebilir. Örnek olarak, biz RMS boyunca göç neuroblasts etiket ve görselleştirmek için bir GFP-ifade plazmid in vivo doğum sonrası elektroporasyon nasıl kullanılacağını açıklar. LoxP sistemi vasıtası ile koşullu knockout farelerde shRNA veya CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon de ilginç genlerin hedeflenmesi için kullanılabilir. Akut beyin dilim kültürlerin Farmakolojik manipulasyon neuroblast göç farklı sinyal moleküllerin rolünü araştırmak için yapılabilir. Time-lapse görüntüleme ile vivo elektroporasyon bağlanmasıyla, biz neuroblast hareketliliği kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak ve geliştirmek için katkıda bulunmayı umuyoruzRomanın Ment beyin tamir teşvik yaklaşır.
Introduction
Memeli beyninde, yeni nöron (nöron) 'nin üretimi başlıca iki bölgede doğumdan sonra ortaya çıkar, hipokampus 1 kıvrımlarının lateral ventriküllere ve subgranular bölgesinin subventricular bölgesi (SVZ). Son yıllarda toplanan önemli kanıtlar hipokampus ve koku alma ampul hafıza fonksiyonları 1-3 doğum sonrası nöron için kritik bir rol destekler. Önemlisi, doğum sonrası nörogenezis aynı zamanda terapötik çünkü dejeneratif nörolojik bozuklukları ile ilişkisi potansiyelini ve beyinde 4-6 yaralı sitelere göç neuroblasts yeteneğini tutar.
Subventricular bölgesi (SVZ) son zamanlarda önemli bir nörojenik niş olarak ortaya çıkmıştır. SVZ'una türetilmiş Nöroblastlar bu doğum sonrası beyin 1,7,8 en uzun göç süreci yapma, rostral göçmen akışı (RMS) aracılığıyla koku ampul (OB) doğru göç ederler. Memeli SVZ / RMS / OB sistemi haline gelmiştirBöyle çoğalması, göç ve farklılaşma 1,8 nörogenezin farklı adımlar, incelemek için yararlı bir model. Birçok büyüme faktörleri ve hücre dışı ipuçları RMS boyunca SVZ'una nörogenezi ve göç düzenleyen, ancak hücre içi moleküler mekanizmalar tam olarak uzak olmaktan 1,9 anlaşılamamıştır. RMS boyunca doğru göç yenidoğan nöronların 10 sonradan olgunlaşması için çok önemlidir. Ayrıca, bazı çalışmalar SVZ'una türetilmiş Nöroblastlar beyin hasarı sitelere 4-6,11-13 için RMS dışına göç olduğunu göstermiştir. Bu durumda, sinyal düzenleyici mekanizmalar neuroblast göç soruşturma nöron anlamak için sadece temel hem de potansiyel terapötik uygulamalar içindir.
Burada, in vivo doğum sonrası elektroporasyon ile SVZ'una sinir atalarıdır etiket ve time-lapse dönen disk konfokal microsco kullanarak akut beyin dilim kültürlerde RMS boyunca onların göç izlemek için ayrıntılı bir protokol açıklarpy. Elektroporasyon yaygın embriyonik yetişkin evrelerinde 14-18 gelişimsel çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu SVZ'una sinir atalarıdır hedef ve işlemek için güçlü bir araçtır ve transgenik modeller 1,15,19,20 viral vektörlerin veya kuşak stereotaktik enjeksiyonu için daha ucuz ve çok daha hızlı bir alternatif temsil eder. Bu ameliyat gerekir ve yüksek sağkalım oranlarına sahip değildir nispeten basit bir işlemdir. ShRNA veya loxP sistemi ilgi genlerin hedeflenmesi ya da SVZ progenitörlerinin kalıcı etiketleme elde etmek, böylece yetişkin nöron çalışmalar 21,22 için yararlı bir araç temsil kullanılabilir kullanılarak fare Genetik modellerde CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon.
Sağlam bir beyin görüntüleme RMS neuroblast göç nedeniyle hala geçerli teknik kısıtlamalar nedeniyle zordur. Ancak, bu süreç uygun bir Sist sağlamak akut beyin dilimleri, konfokal dönen disk time-lapse mikroskopi kullanılarak izlenebilirem yakından farmakolojik manipülasyon 23,24 için de müsait in vivo durum benzer. Time-lapse görüntüleme ile vivo doğum sonrası elektroporasyon Kavrama neuroblast hareketliliğini kontrol moleküler mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak ve beyin tamir teşvik etmek için yeni yaklaşımların gelişmesine katkıda bulunacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
RMS boyunca sinir atalarıdır Verimli göç fonksiyonel nöronlar 10 onların sonraki olgunlaşmasını sağlar. OB yönelik sinir atalarıdır Tanınmış akışları insan bebeklik görülebilir ve erken doğum sonrası insan beyin gelişiminde 27 önemli bir rol oynaması olasıdır. Ayrıca, bu hücreler, yaralanmaya ve nörodejenerasyon 4,28 etkilenen beyin siteleri hedef edebiliyoruz. Gerçek zamanlı neuroblast dinamikleri üzerinde gen manipülasyonu etkisini izlemek için güç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS ve YZ KCL ve KCL-Çin Doktora studentships tarafından desteklenmektedir. MO Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından finanse edildi. Biz Elektroporasyondan değerli tavsiye için Masaru Okabe ve Haziran-ichi Miyazaki PCX-EGFP plazmid ve Alain Chedotal ve Athena Ypsilanti teşekkür ederim.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
