Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.
Uno de los principales beneficios al uso de poli (etilenglicol) (PEG) macrómeros en la formación del hidrogel es versatilidad sintética. La capacidad de extraer de una gran variedad de pesos moleculares de PEG y configuraciones de brazo (número, longitud del brazo, y el patrón de ramificación) proporciona un control estricto sobre los investigadores resultante estructuras de hidrogel y propiedades, incluyendo el módulo de Young y el tamaño de malla. Este video ilustra un método rápido, eficiente, libre de solventes, asistida por microondas de metacrilato precursores de PEG en poli (etilenglicol) dimetacrilato (PEGDM). Este método sintético proporciona materiales de partida muy necesarios para su aplicación en la administración de fármacos y la medicina regenerativa. El método demostrado es superior a los métodos tradicionales metacrilación ya que es significativamente más rápido y sencillo, así como más económico y respetuoso con el medio ambiente, el uso de cantidades más pequeñas de reactivos y disolventes. También vamos a demostrar una adaptación de esta técnica para el metacrilato de resinafuncionalización ilamida de péptidos. Este método en-resina permite que el extremo N-terminal de péptidos a estar funcionalizado con grupos de metacrilamida antes de la desprotección y escisión de la resina. Esto permite la adición selectiva de grupos de metacrilamida a la N-terminales de los péptidos mientras que los aminoácidos con grupos reactivos secundarios (por ejemplo, amina primaria de la lisina, alcohol primario de la serina, treonina de alcoholes secundarios, y fenol de tirosina) permanecen protegidos, la prevención de funcionalización en múltiples sitios. Este artículo detallará métodos analíticos comunes (espectroscopia de resonancia magnética nuclear protónica (, H-RMN) y láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF)) para evaluar la eficiencia de las funcionalizaciones. Errores comunes y sugiere métodos para solucionar problemas se abordarán, como modificaciones de la técnica que se puede utilizar a una mayor funcionalidad macrómero sintonizar e hidrogel resultante física y químicapropiedades. El uso de productos de síntesis para la formación de hidrogeles para administración de fármacos y estudios de interacción célula-material se demostró, con especial atención a la modificación de la composición de hidrogel para afectar al tamaño de malla, el control de la rigidez de hidrogel y la liberación del fármaco.
El poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles son biomateriales comunes utilizados en la medicina regenerativa y la administración de fármacos 1-3 aplicaciones. Estos hidrogeles ofrecen ventajas significativas sobre otros biomateriales. Los hidrogeles de PEG son sintéticos, que ofrece un alto grado de control sobre las propiedades de ingeniería tales como el módulo de elasticidad y la velocidad de degradación en comparación con sus homólogos de biomateriales naturales 1. A medida que se derivan sintéticamente, PEG tiene significativamente menos variabilidad lote a lote frente a los materiales de origen natural-4. Debido a la composición química de PEG, estos hidrogeles son altamente hidrófilos, resistentes a la adsorción de proteínas, y biocompatible 3. Esta resistencia a la absorción de proteínas permite hidrogeles de PEG para actuar como un "pizarra en blanco", que permite a los investigadores a interrogar y estudiar los factores biológicos o químicos específicos (medicamentos, biomoléculas, péptidos de adhesión celular, etc) y los roles específicos estos factoRS juegan en el control de la célula y / o comportamiento de los tejidos.
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Figura 1: Ejemplos de poli (etilenglicol) (PEG) arquitecturas A) PEG lineal B) de PEG de 4 brazos con un núcleo de pentaeritritol C) de PEG de 8 brazos con un núcleo de hexaglicerol D) de 8 brazos de PEG con un…. tripentaeritritol núcleo. n es el número de PEG repite en cada brazo. Cada repetición tiene un peso molecular de 44 g / mol, por lo tanto, n se puede calcular a partir del peso molecular total y la estructura / brazo #.
Precursores de PEG están disponibles con una variedad de arquitecturas y pesos moleculares (Figura 1 ). La variación de la arquitectura (brazo #) y repeticiones de glicol de etileno (n) de PEG puede ser utilizado para controlar las propiedades de las redes de hidrogel formadas a partir de estos macrómeros. Sin modificar PEG contiene grupos hidroxilo terminales que deben reponerse con una funcionalidad alternativa para facilitar la reticulación covalente mediante polimerizaciones, la estrategia de reticulación más comúnmente empleado para los hidrogeles de PEG, antes de la formación de las redes de hidrogel. Hay una variedad de grupos químicos que se pueden incorporar en macrómeros de PEG para facilitar la polimerización y la reticulación de la red (acrilato, metacrilato, vinil éter, norborneno, etc). A pesar de la variedad de funcionalidades terminales disponibles para facilitar la reticulación, sólo hay dos mecanismos por los que puede ocurrir la polimerización:-y paso de crecimiento en cadena (o una mezcla de los dos, de modo mixto).
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Figura 2:.. Teórica esquemática red hidrogel A) de la cadena de crecimiento tradicionales resultados de la polimerización en redes heterogéneas que contienen poli denso (metacrilato) regiones y el aumento no idealidades de red, tales como bucles, precursores sin reaccionar, y los enredos permanentes reticulación B) por crecimiento en etapas polimerización da como resultado estructuras de red significativamente más homogéneas (no a escala).
Funcionalidades que se reticulan a través de la polimerización de crecimiento en cadena no requieren la presencia de un agente de reticulación adicional. Sin embargo, los hidrogeles cadena polimerizada producen estructuras de redes heterogéneas que contienen regiones de reticulación densos (Figura 2A) 1. En contraste, por crecimiento en etapas de polimerización Requires el uso de un agente de reticulación o co-monómero que es reactivo con los grupos funcionales terminales de los macrómeros de PEG. Como los grupos funcionales terminales en el PEG sólo pueden reaccionar con el agente de reticulación y el agente de reticulación sólo pueden reaccionar con los grupos funcionales terminales en la clavija, esto resulta en una mayor estructura de la red homogeneidad (Figura 2B) 1. Polimerizaciones por crecimiento en etapas también típicamente conducen a una mayor conversión de los grupos funcionales, disminuyendo la cantidad de precursores sin reaccionar y el potencial para las respuestas inmunes / inflamatorias debido a solubles, macrómeros no incorporadas 1. Métodos de polimerización de modo mixto también se han desarrollado que combinan tanto la polimerización paso-y de crecimiento en cadena a través del uso de macrómeros que pueden tanto auto-reaccionar (de crecimiento en cadena) y reaccionar con un agente de reticulación (por crecimiento en etapas). Esto produce hidrogeles con características de cada mecanismo de polimerización, y se puede utilizar para producir, diversas estructuras de red más complejas que cualquierapaso o redes de cadena de crecimiento solamente 1.
Mientras que hay una gran cantidad de grupos funcionales que se pueden usar para funcionalizar PEG y facilitar la formación del hidrogel, metacrilatos y norbornenos son algunos de los restos más comunes de polimerización en cadena y por crecimiento en etapas, respectivamente. Ambas funcionalidades ofrecen un excelente control espacio-temporal durante la polimerización de la red, y cuando se usan para encapsular las células, estas redes de apoyo de alta capacidad de supervivencia global de la célula 5-7. Dimetacrilato de PEG funcionalizado (PEGDM) de reticulación a través de la polimerización de la cadena y permite la incorporación de biomoléculas u otros factores través de la co-polimerización con acrilato-, biomoléculas de metacrilato-, o de manera similar funcionalizados-5,6. Hidrogeles PEGDM tienen ventajas significativas sobre los sistemas de polimerización en cadena-alternos de crecimiento tales como acrilato de PEG funcionalizado (PEGDA). El uso de métodos tradicionales, PEGDA puede sintetizarse más rápidamente que PEGDM; hoWever, usando la síntesis asistida por microondas, la síntesis de PEGDM es aún más eficiente. PEGDA a menudo se sintetiza en 8 durante la noche o 24-hr 9 reacciones, pero también se puede sintetizar en cuatro horas a temperaturas elevadas 10. PEGDM también es tradicionalmente sintetizó por reacción de 11 durante toda la noche o durante 24 horas 5, con algunos de los métodos que se extiende el tiempo de reacción 4 días a 12. Utilizando el método asistida por microondas se ha demostrado aquí, PEGDM puede ser producido en una reacción de 5 min. Mientras PEGDM tiene una cinética de reacción más lentas que PEGDA 13, la reacción de reticulación para PEGDM sigue siendo rápida, que ocurre en minutos, y consigue una mayor conversión de macrómero de PEGDA como el aumento de la hidrofobicidad del grupo de metacrilato aumenta la agregación de grupo funcional en solución, lo que aumenta la probabilidad de la transferencia y la conversión radical metacrilato 14. Hidrogeles PEGDM también se asocian con el aumento de la viabilidad celular y el crecimiento comoen comparación con hidrogeles PEGDA, probablemente debido a la disminución de la velocidad de reacción en un momento dado, lo que reduce la concentración de radical y macrómeros sin reaccionar presentes 14. Polimerizaciones-tiol-eno como los que emplean PEG (PEGN) forman hidrogeles norborneno funcionalizado mediante polimerización por crecimiento en etapas, y requieren el uso de PEGN y un agente de reticulación que contiene un promedio de más de dos grupos funcionales. Desde tiilo radicales reaccionan con uniones norborneno carbono-carbono dobles, multi-tiol que contiene agentes de reticulación se utilizan comúnmente para reticular hidrogeles PEGN, lo que permite fácil incorporación de péptidos con aminoácidos cisteína funcionalidades 7. Si bien existen numerosas otras químicas que reaccionan por polimerización por crecimiento en etapas (reacciones de adición de Michael como tiol-acrilato 15 y sulfona tiol vinilo 16 "clic" reacciones como alquino-azida 17, etc), los hidrogeles tiol norborneno son muy común, como la cepa deel anillo de norborneno aumenta significativamente la velocidad de reacción y disminuye la probabilidad de la polimerización de doble cadena que experimenta enlace norborneno 7.
La decisión entre el metacrilato, norborneno, o funcionalización alternativo para facilitar la formación de hidrogel se basa en gran medida en el enfoque. Por ejemplo, la cadena-de crecimiento redes PEGDM polimerizado se han demostrado como muy adecuado para controlar la localización de células en el desarrollo de una ingeniería de tejidos periostio 18,19. Por crecimiento en etapas polimerizado redes de PEG son más adecuados para la incorporación de secuencias de péptidos para facilitar la degradación de hidrogel enzimáticamente-sensible, debido a la facilidad de incorporación de las secuencias de sustrato de la enzima utilizando tiol (cisteína) que contiene péptidos y norborneno macrómeros funcionalizados 20. Si la pregunta de investigación se aborda mejor mediante el uso de hidrogeles paso de crecimiento, Fairbanks et al. Proporciona una descripción detallada de la norborestrategia de funcionalización nene para PEG 7. Este detalle voluntad de papel cómo PEG y secuencias de péptidos se pueden funcionalizar (con un metacrilato de PEG, y una metacrilamida de péptidos) para reacciones de polimerización en cadena.
Tradicionalmente, PEGDM se produce haciendo reaccionar PEG con cloruro de metacriloilo y trietilamina en diclorometano. La reacción se deja avanzar durante la noche a temperatura ambiente 11 durante 24 horas o 5, con algunos de los métodos que se extienden tiempo de reacción 4 días a 12 antes de la filtración, la precipitación en éter dietílico, y la recolección. Aunque existen muchas variaciones de este enfoque, todos son mucho tiempo, requieren una amplia gama de equipos de síntesis química, y no son el medio ambiente, ya que implican el uso de cantidades relativamente grandes de reactivos de alta pureza y solvente. Para sortear estas limitaciones, Lin-Gibson et al. Desarrollaron un método libre de solventes asistida por microondas para funcionalizar PEG con te grupos metacrilato rminal (Figura 3A) 12. En esta reacción, los grupos alcohol terminales del PEG reaccionan con uno de los átomos de carbonilo del anhídrido metacrílico para formar un carboxilo. Esto genera el producto PEGDM, con ácido metacrílico como producto secundario. Esta síntesis tiene muchas de las ventajas características de la síntesis de microondas, incluida la reducción del tiempo de reacción y métodos de síntesis sin disolventes 21. La síntesis de microondas es preferible a los métodos discutidos anteriormente, ya que es significativamente más rápido, requiere un equipo menos extensa de síntesis (por ejemplo, material de vidrio, placas de reacción), y utiliza menos reactivo global y cantidades de disolventes como disolventes sólo son necesarios para la purificación del producto / colección y no para síntesis, lo que es más económica y respetuosa con el medio ambiente.
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Figura 3:. Esquemas de funcionalización A) de poli (etilenglicol) se hace reaccionar con un exceso molar de 10 veces de anhídrido metacrílico para producir poli (etilenglicol) metacrilato B) Este mismo método se puede usar para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, formando una. metacrilamida péptido funcionalizado. Mediante la realización de este procedimiento antes de escindir el péptido de la resina, la funcionalización selectiva de la N-terminal se puede realizar como grupos laterales de aminoácidos permanecen protegidos. n: número de PEG repite en el macrómero (n = 45,5, 227 y 455, respectivamente, para el 2, 10, y 20 kDa PEG lineal se utiliza). R1 a RN: cadenas laterales de aminoácidos. PG1 a PGN: protectores de cadena lateral grupos. TFA: ácido trifluoroacético. Consejos: triisopropilsilano. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H 2 O: agua.
El método de metacrilación asistida por microondas se ha adaptado recientemente por nuestro grupo para funcionalizar el extremo N-terminal de péptidos con grupos de metacrilamida (Figura 3B) para facilitar la incorporación del péptido en una variedad de polímeros y redes poliméricas. En esta reacción, la amina primaria de la N-terminal del péptido reacciona con el átomo de carbonilo en el anhídrido metacrílico para formar una amida. Esto genera el péptido funcionalizado metacrilamida, con ácido metacrílico producido como un producto secundario. Cuando se utiliza este procedimiento para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, es importante que los aminoácidos que contienen cadenas laterales reactivas (aminas primarios (lisina), alcoholes (serina, treonina), y fenoles (tirosina)) están protegidos durante la funcionalización, y grupos protectores sólo se escinden después de la incorporación metacrilamida.
Este artículo demostrará ambos microondmétodos de ave con ayuda de sintetizar PEGDM y funcionalizar secuencias de péptidos sobre resina, destacando las dificultades comunes y sugiriendo métodos de solución de problemas. En este artículo, los métodos para la realización de técnicas químicas analíticas empleadas comúnmente para evaluar la funcionalización de productos se detallarán, y se les dará sugerencias y recursos para realizar modificaciones más avanzadas. Los resultados típicos se demostraron, que incluyen el uso de la PEGDM sintetizada para formar redes de hidrogel, la explotación de los hidrogeles formados para controlar la liberación de un fármaco modelo, y el empleo de péptidos funcionalizados para facilitar las interacciones célula-hidrogel. Se prestará especial atención a la caracterización de hidrogel de tamaño de malla y discutir cómo la composición de hidrogel se puede ajustar para afectar a esta propiedad física subyacente, que a su vez controla las propiedades del material a granel, tales como la rigidez y el perfil de liberación del fármaco.
Los métodos ilustrados anteriormente son de gran valor para la síntesis de PEGDM y metacrilamida funcionalización de péptidos u otros compuestos que contienen amina. Estos materiales se pueden utilizar para la medicina regenerativa y aplicaciones de administración de fármacos. Debido a la naturaleza hidrofílica de PEG, los hidrogeles formados a partir de macrómeros de PEG tienen un alto contenido de agua similar a muchos tejidos en el cuerpo 2. Esta cualidad hace PEG muy resistentes a la adsorción de proteínas y, por tanto, inerte en el cuerpo 3. Sin embargo, la naturaleza higroscópica de PEG puede resultar problemático durante funcionalización. Si el agua está presente en la muestra de PEG durante el procedimiento de metacrilación, el anhídrido metacrílico reaccionará preferentemente con agua para producir ácido metacrílico, y pobres funcionalización de PEG resultará.
Por lo tanto, uno de los pasos más importantes que se pueden tomar para asegurar metacrilación exitosa del PEG o péptido es mantener anhidrocondiciones de reacción de Rous. El paso recomendado de secar el material de vidrio antes de su uso se destina a prevenir la contaminación del agua. La presencia de agua en la muestra se puede ver en el análisis de RMN, como un pico ancho a 1,7 ppm (Figura 4). Si se observa pobres metacrilación incluso después de secar el material de vidrio, los productos químicos se pueden secar sobre sulfato de sodio u otros agentes de secado (tamices moleculares, etc) antes de su uso. La destilación también se puede utilizar para eliminar el agua y purificar anhídrido metacrílico antes de su uso, y la destilación azeotrópica se puede utilizar para secar PEG 23. En casos extremos, la síntesis puede llevarse a cabo en una caja de guantes para garantizar más adecuadamente las condiciones anhidras. Una segunda ronda de metacrilación, siguiendo el mismo procedimiento, también se puede realizar para aumentar funcionalización. Porque siempre hay una posibilidad de que se requerirán rondas adicionales de funcionalización, se debe tener cuidado en el paso 1.7 y 1.9 para recoger rápidamente PEGDM por filtración al vacío. La filtración al vacío durante más tiempo del absolutamente necesario aumenta la exposición de PEG al aire, lo que aumenta la posibilidad de que la absorción de agua.
A pesar de que el porcentaje de exceso de anhídrido metacrílico a los grupos funcionales hidroxilo se mantiene sin cambios, el aumento de la funcionalización de PEG (por ejemplo, el brazo #) en el precursor de PEG se asocia generalmente con una disminución en el porcentaje de funcionalización obtenidos (resultados no publicados, de laboratorio Benoit). Para abordar preventivamente esta reducción en la eficiencia de funcionalización, o si se encuentran dificultades particulares lograr suficientemente alta funcionalización, la duración de la reacción de microondas se puede aumentar, a condición de que el intervalo de microondas se mantiene a 30 seg. Mientras exceso molar de 10 es típicamente suficiente, la cantidad de anhídrido metacrílico utilizado en la reacción también se puede aumentar para aumentar el porcentaje de funcionalización alcanzado 12.
Es importante que eletapa de precipitación adicional (1.9) puede realizar para lograr buenos señales de RMN. Si bien es tentador para llevar a cabo la segunda precipitación el mismo día que la síntesis, el secado de la muestra durante la noche antes se ha encontrado reprecipitación para ayudar a la eliminación del exceso de anhídrido metacrílico y ácido metacrílico. Preparación de la muestra también es importante para el logro de los espectros de RMN limpio, y por lo tanto, las muestras deben prepararse utilizando las condiciones recomendadas. Figura 4 demuestra representativos 1 resultados H-RMN para funcionalizado correctamente PEGDM. Mediante el análisis de la relación de protones metacrilato terminales a centrales protones PEG, el PEGDM estaba decidido a ser funcionalizado adecuadamente. Preparación de la muestra MALDI es igualmente importante para lograr una lectura clara. MALDI es particularmente sensible a la presencia de sales y las altas concentraciones de la muestra. Si un MALDI clara lectura (una intensidad por encima de 50 unidades arbitrarias (UA) con una señal de alta: ruido) no se puede conseguir, la muestra slución debe ser diluido 1:100 en MALDI disolvente antes de combinarse con la solución de matriz y volverse a analizar. La Figura 5 muestra los resultados de MALDI-TOF representativos después de funcionalización correcta péptido, la escisión, y preparación de la muestra. La escisión de una pequeña muestra de resina antes de la funcionalización (Figura 5A) muestra correcta síntesis de la GKRGDSG péptido, con funcionalización metacrilamida correcta del péptido se muestra en la Figura 5B.
Mientras que la funcionalización de los péptidos sobre resina es un procedimiento relativamente robusta, las condiciones de escisión requeridas para cada secuencia a menudo requiere la sintonización. Para las secuencias largas en las que muchos aminoácidos han protegido las cadenas laterales (> 30 aminoácidos de longitud, o> 15 aminoácidos con grupos de protección), la duración de la escisión se debe aumentar en una hora. Sin embargo, si el tiempo de escisión se extiende demasiado, la escisión del enlace péptido puede resultar debido a la exposición ácida a largo plazo. MALDI ana lisis puede ser muy útil para revelar los errores que se produjeron en la síntesis de péptidos o escote. Una disminución observada por debajo de los pesos moleculares esperados puede indicar que el ácido (s) amino no lo hizo correctamente pareja, o que el fraccionamiento péptido producido (ver Tabla 2 para las fuentes de los cambios observados comúnmente en el peso molecular). Si el peso molecular observado es mayor de lo esperado por el peso de un grupo protector utilizado, es probable que la escisión y desprotección eran insuficientes y el péptido se deben recleaved de tiempo adicional.
Aminoácidos borrado | Cambio MW (g / mol) | Protecting Groups no escindido | x; "> Cambio MW (g / mol)Los iones comúnmente presentes | Cambio MW (g / mol) | |
Ala | -71 | Acetilo | 42 | Cl – | 35 |
Arg | -158 | Alilo | 40 | K + | 39 |
Asn | -114 | Alloc | 85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
Áspid | -115 | Boc | 100 | De Na + | 23 |
Cys | -103 | Fmoc | 223 | ||
Gln | -128 | OtBu | 56 | ||
Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
Gly | -57 | tBu | 56 | ||
Su | -137 | Trt | 242 | ||
Ile | -113 | ||||
Leu | dth: 64px; "> -113|||||
Lys | -128 | ||||
Met | -131 | ||||
Phe | -147 | ||||
-97 | |||||
Ser | -87 | ||||
Thr | -101 | ||||
Trp | -186 | ||||
-147 | |||||
Val | -99 |
Tabla 2. Observa con frecuencia cambios en el péptido de peso molecular.
Los macrómeros producidos utilizando métodos metacrilación asistidas por microondas se pueden utilizar en un número de la medicina regenerativa o aplicaciones de administración de fármacos. Los péptidos funcionalizados y PEGDM sintetizados aquí también se pueden incorporar en polímeros utilizando nitróxido mediada por polimerización (NMP), Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) o reversible AddiTransferencia ción-fragmentación (RAFT) métodos 24. Redes de hidrogel también se pueden producir en presencia de las células, como se ha demostrado previamente en el artículo JoVe por Khetan y Burdick 22. Esto a menudo requiere la incorporación de péptidos de adhesión celular tales como RGD o moléculas de la matriz extracelular, como PEG solo no proporciona las interacciones célula-material crítico para la supervivencia y la función de algunos tipos de células 25. Los péptidos, por ejemplo, se pueden sintetizar utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida tradicional y funcionalizados como se describe aquí para permitir la incorporación en redes de hidrogel. Como se ve en la Figura 6, la inclusión de la adhesión celular péptido metacrilamida-funcionalizado GK RGDS G en hidrogeles (0,5 mM) facilita la adhesión de las células madre mesenquimales humanas (MSCs) a las superficies de hidrogel de PEG, el aumento del número de células adjunto y propagación (Figura 6B ), en comparación con PEG hidrogeles sin el péptido de adhesión celular ( <strOng> Figura 6A). Sin embargo, el trabajo previo ha demostrado que las interacciones célula-material de se han mejorado aún más por la inclusión de 3.400 Da espaciadores de PEG entre péptidos adhesivas y redes de hidrogel, para reducir-péptido integrina impedimento estérico. Sin la inclusión del espaciador, las células pueden interactuar con hidrogeles de PEG a través de proteínas no específicas que se adsorben al péptido, en lugar de a través de interacciones integrina mediada con péptidos 26. Para incorporar este espaciador de PEG y evitar interacciones no específicas, los péptidos pueden conjugarse con monofuncionalizado de PEG a través de N-hidroxisuccinimidilo activado ésteres, tal como se describe por Hern y Hubbell 26.
Aplicaciones de las redes de hidrogel requieren un estricto control sobre las propiedades del material. Una ventaja significativa de hidrogeles de PEG es un alto grado de control sobre estas propiedades. Por ejemplo, el peso molecular, el brazo número, y el% en peso de PEG utilizado en la formación de redes de hidrogel se puede alterar para ajustar con Tunpropiedades electrónicas para aplicaciones específicas. Esto permite un estricto control sobre hidrogel tamaño de malla (ξ), que controla hidrogel relación de hinchamiento (Q) y la rigidez (módulo de elasticidad, E). Esto se ilustra en la Figura 7A y se cuantifica en la Figura 8, donde el aumento de PEG resultados macrómeros de peso molecular en un aumento de tamaño de malla de hidrogel (Figura 8A) y una disminución en la rigidez de hidrogel (Figura 8B).
La característica física subyacente que controla el comportamiento mayor en estas redes de hidrogel, tamaño de malla, se calcula utilizando la ecuación de Flory-Rehner 16. Para realizar este cálculo, la relación de hinchamiento volumétrico (Q) se calcula primero a partir de la ecuación 4:
(4)
donde ρ s es la densidad del agua (1 g / ml), ρ es la densidad p de PEG (1,12 g / ml), H s es masa hinchada del hidrogel y M D es la masa seca del hidrogel (a menudo se mide después de la congelación y liofilización de los hidrogeles). El peso molecular entre reticulaciones (M C, en g / mol) se calcula entonces a partir de la ecuación 5:
(5)
donde M N es el promedio en número MW de PEG (en g / mol), es el volumen específico del polímero , V 1 es el volumen molar del agua (18 ml / mol), V 2 es la fracción de volumen de polímero de equilibrio del hidrogel
( ), Y X 1 </sub> es el parámetro de interacción polímero-disolvente para PEG y agua (0,426) 16. El número de enlaces entre entrecruzamientos (n) se calcula a partir de la ecuación 6:
(6)
donde N b es el número de enlaces en la repetición de PEG (3) y M r es el MW de la repetición de PEG (44 g / mol) 27. Esto permite que la distancia de la raíz cuadrada media de extremo a extremo de la cadena polimérica (En nm) que se calcula a partir de la ecuación 7:
(7)
donde l es la longitud media de enlace (0.146 nm, calculado sobre la base de CC y CO longitudes de enlace) y C n es la relación característica del polímero (4.0 para PEG) 28. FiFinalmente, el tamaño de malla del hidrogel se puede calcular de la ecuación 8:
(8)
Propiedades de hidrogel de manera similar se pueden ajustar mediante el ajuste de la cantidad de PEG utilizado en la formación de hidrogeles. Disminuyendo el porcentaje en peso de los resultados de macrómeros de PEG en un aumento en el tamaño de malla de hidrogel, lo que reduce posteriormente la rigidez de hidrogel. Figura 7B ilustra y la Figura 9 cuantifica como el porcentaje en peso de PEG utilizado en la formación del hidrogel se puede utilizar para controlar el tamaño de malla (Figura 9A) y la rigidez de hidrogel resultante (Figura 9B). Como la rigidez sustrato se ha demostrado que afectan a los comportamientos celulares, tales como diferenciación de células madre 29, la capacidad de controlar estrechamente la rigidez es una característica importante en la fabricación de hidrogel.
Los hidrogeles también se pueden utilizar para CONTRla administración de fármacos ol. Como se ilustra en la Figura 7A y demostrado en la Figura 10, el aumento del peso molecular de los macrómeros de PEG aumenta el tamaño de malla de la red de hidrogel, aumentando posteriormente la liberación de fármaco modelo encapsulado, albúmina de suero bovino (BSA). Mientras que las muestras de hidrogel en este estudio fueron destruidos en t = 195 horas para permitir la medición de hidrogel de masas húmedas y secas para los cálculos del tamaño de malla, es nuestra experiencia que siguió la liberación de BSA ocurriría habían incubado las muestras durante períodos de tiempo más largos. La liberación incompleta de BSA al observado en la Figura 10 no es inesperado, como otros grupos también han informado de que la BSA es resistente a la difusión dentro de las redes de hidrogel de PEG 30. Liberación incompleta de la proteína encapsulada puede ocurrir debido a enlaces de hidrógeno entre las proteínas y los macrómeros de PEG, o la unión entre el grupo metacrilato en el PEG y los grupos amino primarios en los residuos de lisina en BSA al 31 covalente </sarriba>. Además, BSA es propenso a la agregación y la formación de enlaces disulfuro con el tiempo, lo que puede aumentar su radio efectivo de Stokes y obstaculizar su liberación a partir de hidrogeles. Como hidrogeles cadena-de crecimiento, tales como estos hidrogeles PEGDM, son propensos a no idealidades de la red y de hidrogel heterogénea tamaño de malla (Figura 2A), también es posible que una fracción de la de BSA encapsulado está contenido en las regiones del hidrogel que tiene malla significativamente más pequeños tamaño que el promedio general dentro del gel, evitando su liberación. Mientras que se observó, de liberación nonFickian incompleta (datos no mostrados) de encapsulado de BSA en este caso, la liberación controlada de Fick de numerosos otros fármacos modelo, incluyendo la insulina y la ovoalbúmina, se ha demostrado usando PEGDM similares hidrogeles 30. Además, Watkins y Anseth han utilizado microscopía confocal de barrido láser para demostrar que la liberación de moléculas fluorescentes de hidrogeles similares se modela aceptablemente con la difusión de Fick míthods 32.
Mientras que los hidrogeles formados en este estudio no son degradables, la degradación de la red es otro parámetro que puede ser incorporado en y afinado dentro de estas redes. Proporcionar para la degradación controlada de hidrogel puede dar lugar a alteraciones en el comportamiento celular 33, la promoción de crecimiento de tejido o huésped crecimiento de tejido, o la eliminación de la necesidad de explantación 34. Hidrogeles de PEG degradables son comúnmente sintetizados por apertura de anillo d hidrolíticamente degradable, l-láctico, glicólico o grupos ε-caprolactona en grupos hidroxilo dentro PEG antes de metacrilación 35. Estos tres grupos se degradan por hidrólisis de funcionalidades de éster, con los ésteres de glicólido que tiene la mayor susceptibilidad a la degradación, seguido de lactida, y éster de caprolactona, debido a su variación de la hidrofobicidad. Después de la incorporación de grupos hidrolíticamente degradables, el PEG se puede funcionalizar adicionalmente usando el procedimiento metacrilación detaileD en este artículo, lo que permite la formación de redes de hidrogel a través de la polimerización en cadena iniciada por radicales posterior 36,37. La tasa de degradación de las redes de hidrogel se puede controlar mediante la variación de la identidad del grupo hidrolíticamente degradable (glicolida, lactida, etc) y variando el número de repeticiones degradables incorporados a la estructura 35,38.
Teóricamente, los métodos demostrados aquí se podrían utilizar para la acrilación de PEG y péptidos mediante la sustitución del anhídrido metacrílico con anhídrido acrílico en los pasos 1.3 y 3.3, respectivamente. Sin embargo, anhídrido acrílico es más de 20 veces el coste de anhídrido metacrílico 39,40, haciendo acrilación asistida por microondas significativamente menos atractiva que metacrilación asistida por microondas.
Hemos demostrado un método simple y rápido para funcionalizar PEG y péptidos, la forma de evaluar la eficacia de este procedimiento, y teniendo en cuenta los recursos para ucantan los materiales sintetizados para formar redes de hidrogel. Estas herramientas sintéticos son muy versátiles en sus aplicaciones, y deben demostrar un elemento básico en cualquier número de laboratorios de investigación de entrega de materiales y medicamentos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado en parte por una beca Howard Hughes Med-en-Grad (AVH), con fondos iniciales proporcionados a la Dra. Danielle Benoit de la Universidad de Rochester y la Fundación de Investigación y Educación Ortopédica / Trasplantes Musculoesqueléticos Foundation (OREF / MTF). Los autores desean agradecer al Dr. James L. McGrath para el uso de su equipo.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |