이 비디오는 연쇄 중합 및 하이드로 겔의 합성을 가능하게, 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 신속하고 효율적인 방법을 도시한다. 그것은 유사하게 작용의 효율성을 평가하는 문제 해결 및 고급 수정에 대한 제안을 제공하고, 일반 하이드로 겔의 특성 기술을 설명하는 펩티드, 세부 일반적인 분석 방법으로 메타 크릴의 기능을 소개하는 방법을 보여줍니다.
폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 하이드로 겔 형성 마크 로머를 사용하는 주요 이점 중 하나는 합성 다양성이다. PEG 분자량과 구성의 큰 다양성에서 그릴 수있는 기능 (팔 수, 길이, 팔 및 분기 패턴) 하이드로 겔의 구조와 탄성 계수와 메쉬 크기 등의 속성을 결과를 통해 연구자 엄격한 제어를 제공한다. 이 비디오는 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 (PEGDM)에 PEG 전구체를 메타 크릴 레이트에 신속하고 효율적으로, 무용제, 전자 레인지를 이용한 방법을 설명 할 것이다. 이 합성 방법은 약물 전달 및 재생 의료에 대한 응용 프로그램에서 많이 필요한 원료를 제공합니다. 이 시약 및 용매의 적은 양을 사용하여, 속도가 매우 빠르고 간단뿐만 아니라,보다 경제적이고 환경 친화적으로 입증 된 방법은 기존의 메타 크릴 화 방법에 우수합니다. 우리는 또한 온 – 수지 methacr이 기술의 적응을 설명 할 것이다펩티드의 일 아마이드 작용. 여기에 수지 방법은 펩타이드의 N-말단 이전 수지의 탈 보호 및 분열에 메타 크릴 그룹으로 기능화 할 수 있습니다. 반응성 측기 (라이신 예 차 아민, 세린의 일차 알코올, 트레오닌의 이차 알코올 및 티로신의 페놀)과 아미노산 등이 작용을 방지, 보호 된 상태로 유지하면서이 펩티드의 N-말단에 메타 크릴 기의 선택적 첨가 허용 여러 사이트에서. 이 글을 자세히 설명 할 것입니다 일반적인 분석 방법, 관능 화의 효율성을 평가하기 위해 (양성자 핵 자기 공명 분광법 (H-NMR)와 매트릭스 비행 질량 분석의 레이저 탈착 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 보조). 일반적인 함정과 문제 해결 방법을 제시하여 추가 조정 로머 기능을 사용할 수있는 기술과 생성 된 하이드로 젤의 의지 수정으로 해결 될 것입니다 물리, 화학,속성. 특히주의가 하이드로 겔 강성 및 약물 방출을 제어 메쉬의 크기에 영향을 하이드로 겔 조성물을 수정 지급과 약물 전달 및 세포 물질의 상호 작용 연구를위한 하이드로 젤의 형성을위한 합성 제품의 사용은 입증 될 것입니다.
폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 하이드로 겔은 재생 의학 및 약물 전달 응용 프로그램 1-3에서 사용되는 일반적인 생체 물질이다. 이러한 하이드로 겔은 다른 생체 재료에 비해 상당한 이점을 제공합니다. PEG 하이드로 겔은 자연 생체 적합 물질 대응 1에 비해 탄력과 분해 속도 계수 등의 기술 특성에 대해 높은 수준의 제어 기능을 제공하고, 합성이다. 그들은 합성 파생 된 바와 같이, PEG 자연 유래 소재 4 대 훨씬 적은 배치 별 변화가 있습니다. PEG의 화학 조성으로 인해,이 하이드로 겔은 높은 친수성 단백질 흡착에 저항하고, 3 생체 적합성이다. 단백질 흡착이 저항은 PEG 하이드로 겔 특정 생물학적 또는 화학적 요인 (약물, 생체 분자, 세포 접착 펩타이드 등) 및 특정 역할이 사실상 심문하고 연구하는 연구원을 가능하게 '백지'로 작동 할 수 있습니다RS 세포 및 / 또는 조직의 행동을 제어에서 재생.
그림 1…. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 아키텍처와 헥사 글리세롤 코어 D) 8 – 아암 PEG와 펜타 에리트 리톨 코어 C) 8 – 아암 PEG와 A) 선형 PEG B) 4 – 아암 PEG의 예 코어를 리톨. N은 PEG의 수는 각 팔에 반복합니다. 각 반복 따라서, 44g / 몰의 분자량을 갖는 N 전체적인 분자량 및 구조 / 팔 번호로부터 계산 될 수있다.
PEG 전구체 구조 및 분자량의 다양한 사용할 수 있습니다 (그림 1 ). 아키텍처 (팔 위) 변화와 PEG의 에틸렌 글리콜 반복 (n)은 이러한 로머로부터 형성된 하이드로 겔 네트워크의 특성을 제어하기 위해 사용될 수있다. 수정되지 않은 PEG는 중합 전에 하이드로 겔 네트워크 형성에 PEG 하이드로 겔, 가장 일반적으로 사용되는 가교 전략을 통해 공유 가교 결합을 용이하게하기 위해 다른 기능으로 대체해야합니다 말단 히드 록 그룹이 포함되어 있습니다. 중합 및 가교 네트워크 (아크릴 레이트, 메타 크릴 레이트, 비닐 에테르, 노르 보르 넨 등)을 촉진하기 위하여 PEG 로머로 혼입 될 수있는 화학적 기의 다양한있다. 스텝 – 사슬 성장 (또는이 혼합 모드의 혼합물) : 가교 결합을 촉진하기 위하여 사용할 터미널 기능의 다양성에도 불구하고, 중합이 발생할 수있는 두 개의 메커니즘이있다.
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그림 2 :.. 지역과 같은 루프, 미 반응 전구 물질, 영구 얽힘으로 증가 네트워크 비 이상성 (nonideality) 가교 밀도 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 포함하는 이종 네트워크의 이론적 인 하이드로 겔 네트워크 회로도 A) 전통적인 연쇄 성장 중합 결과 B) 단계 성장 중합 결과 훨씬 더 균일 한 네트워크 구조는 (확장하지 말 것).
연쇄 성장 중합 반응을 통해 가교 결합 작용기는 추가로 가교제의 존재를 필요로하지 않는다. 그러나, 연쇄 중합 하이드로 겔은 조밀 한 가교 영역 (그림 2A) 1을 포함하는 이기종 네트워크 구조를 생성한다. 반면, 단계 성장 중합 requi에PEG 로머의 말단 관능기와 반응하는 가교제 또는 코 모노머의 사용을 입술. PEG의 말단 관능기는 가교 결합제와 반응 할 수 있고, 가교제는 PEG의 말단 관능기와 반응 할 수있는 바와 같이, 이는 더 큰 네트워크 구조의 균질성 (도 2B) 결과 1. 단계 성장 중합은 일반적으로 수용성, 비법 인 로머 1에 의한 면역 / 염증 반응에 대한 반응 전구 물질과 잠재력의 양을 감소, 작용기의 높은 변환을 초래할. 혼합 모드의 중합 방법은 (사슬 성장을) 자기 반응 가교제 (단계 성장)과 반응 할 수있는 두 로머의 사용을 통해 두 단계 및 연쇄 성장 중합을 결합하여 개발되었다. 이것은 각각의 중합기구의 특성 하이드로 겔을 생성하고,보다 복잡하고 다양한 네트워크 구조를 생성하기 위하여 사용될 수있다 하나보다단계 또는 단독으로 1 사슬 성장 네트워크.
PEG를 기능화 및 하이드로 겔 형성을 촉진하는데 사용될 수있다 작용기의 과다가 있지만, 메타 크릴 레이트 및 노보 넨은 각각 일반적인 사슬 – 단계 성장 중합 잔기의 일부이다. 이러한 기능은 모두 네트워크 중합에 우수한 시공간 제어를 제공하고, 세포를 캡슐화하는 데 사용하는 경우, 이러한 네트워크는 전반적으로 높은 세포 생존 5-7를 지원합니다. 연쇄 중합 반응을 통해 기능화 PEG (PEGDM) 가교를 메타 크릴 레이트 및 아크릴 레이트, 메타 크릴 레이트, 또는 이와 유사하게 기능화 된 생체 분자 5,6와 공동 중합을 통해 생체 분자 또는 다른 요인의 결합을 허용합니다. PEGDM의 히드로 겔은 아크릴 레이트 작용 PEG (PEGDA)로 대체 연쇄 성장 중합 시스템에 비해 상당한 장점이있다. 전통적인 방법을 사용하여, PEGDA가 PEGDM보다 빠르게 합성 될 수있다; 호Wever에게이 전자 레인지를 이용한 합성을 사용하여, PEGDM 합성이 더 효율적입니다. PEGDA 종종 하룻밤 8 또는 24으로 15 시간 반응에서 합성되고, 또한 고온에서 열 사시간 합성 할 수있다. PEGDM은 또한 전통적으로 어떤 방법 사일 (12)로, 반응 시간을 연장하여, 하룻밤 (11)의 반응에 의해 또는 24 시간 5 위해 합성된다. 여기서 설명 마이크로파를 이용한 방법을 사용하여,이 PEGDM 5 분간 반응에서 제조 될 수있다. PEGDM가 PEGDA 13보다 느린 반응 속도를 가지고 있지만, PEGDM위한 가교 반응은 분에서 발생 여전히 신속하고, 이에의 확률을 증가 크릴 기 용액 중의 관능기 응집을 증가 증가 소수성으로 PEGDA보다 로머 변환을 달성 급진적 전송 및 메타 크릴 레이트 변환 14. PEGDM의 히드로 겔은 증가 된 세포의 생존과 성장 등과 관련된때문에 급진적 인 농도와 14 현재 미 반응 로머을 감소 주어진 시간에서 반응 속도의 감소에 대한 가능성이 PEGDA 하이드로 겔에 비해. 이러한 단계 성장 중합 통해 노보 넨 기능화 PEG (PEGN) 형태를 사용하는 하이드로 겔 및 PEGN의 사용이보다 큰 평균 작용기를 포함하는 가교 결합제를 필요로하기 티올 – 엔 중합. 티일 라디칼은 시스테인 아미노산 작용기 7 펩티드의 손쉬운 혼입 허용 넨 탄소 – 탄소 이중 결합, 멀티 티올 함유 가교제 일반적 PEGN 하이드로 겔을 가교 결합하는 데 사용된다,와 반응하기 때문이다. 단계 성장 중합 반응을 통해 반응하는 수많은 다른 화학이 있지만 (예 : 싸이 – 아크릴 레이트 (15)와 티올 – 비닐 술폰 16 마이클 – 부가 반응, 같은 알킨 – 아 지드 (17) 등의 반응을 "클릭"), 티올 – 노보 넨 하이드로 겔은 매우 일반적인, 변형 등의노르 보르 넨 고리는 크게 반응 속도를 증가시키고 넨 이중 결합 겪고 사슬 중합 (7)의 기회를 감소시킨다.
하이드로 겔 형성을 촉진하는 메타 크릴 레이트, 노르 보르 넨, 또는 대체 작용 간의 결정은 큰폭 접근법에 기초한다. 예를 들어, 연쇄 성장 중합의 PEGDM 네트워크뿐만 아니라 입증 조직 공학 골막 18, 19의 개발에 세포의 현지화를 제어에 적합하고 있습니다. 단계 성장 중합 PEG 네트워크 인해 티올 (시스테인) 펩티드를 함유하여 효소 기질 서열의 혼입의 용이성, 효소 반응하는 하이드로 겔 열화를 촉진하는 펩티드 서열의 혼입에 더 적합하며 기능화 로머 (20)를 노르 보르 넨. 연구 질문은 최고의 단계 성장 하이드로 젤의 사용에 의해 해결 될 경우, 페어 뱅크스 등이. norbor에 대한 자세한 설명을 제공합니다PEG 7 네네의 작용 전략. 이 논문의 의지 세부 방법 PEG와 펩타이드 서열 (PEG에 대한 메타 크릴 레이트로, 펩티드의 메타 크릴) 관능 연쇄 중합 반응에 대한 수 있습니다.
전통적 PEGDM 디클로로 메탄 메타 크릴로 일 클로라이드 및 트리 에틸 아민과 PEG를 반응시켜 제조된다. 반응물을 여과, 디 에틸 에테르에 침전 및 수거 전에 사일 (12)로, 반응 시간을 연장하는 몇 가지 방법으로, 실온에서 밤새 11 또는 24 시간 5 경과하는 것이 허용된다. 이 방법의 많은 변형이 존재하지만, 모든 시간 소모적이다 화학 합성 장치의 큰 어레이를 필요로하고, 그들이 고순도 시약 및 용매의 상대적으로 많은 양의 사용을 포함 같이, 환경 친화적 않는다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 린 깁슨 등. 테와 PEG를 기능화 할 수있는 전자 레인지를 이용한, 무용제 방법을 개발 rminal 메타 크릴 레이트 그룹 (그림 3A) 12. 이 반응에서, PEG의 말단 알콜 기는 카르복실기를 형성하는 메타 크릴 산 무수물의 카본 원자 중 하나와 반응. 이 부산물로서 메타 크릴 산, PEGDM 생성물을 생성한다. 이 합성은 감소 된 반응 시간 및 무용제 합성 방법 (21)을 포함하여 마이크로파 합성 특징적 장점을 많이 갖는다. 마이크로파 합성은 상당히 빠른로, 앞에서 설명한 방법에 바람직하다 덜 광범위한 합성 장비 (예를 들어, 유리, 반응 판)을 필요로하고, 용매 만 제품 정제 / 수집 및하지 않는 필요로 적은 전체 시약 및 용매 양을 사용 합성,보다 경제적이고 환경 친화적 인 만들기.
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도 3 :.. 기능화 개략도 A) 폴리 (에틸렌 글리콜)을 형성하는 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 B)이 같은 방법은 펩티드 서열의 N-말단을 기능화하는데 사용될 수를 생성하기 위해 10 배 몰 과량의 메타 크릴 산 무수물과 반응 기능화 펩타이드를 메타 크릴. 종래 수지로부터 펩티드를 클 리빙이 절차를 수행하여, N-말단의 선택적인 작용은 아미노산 측 개 보호 유지로 수행 될 수있다. N : PEG의 수는 (2, 각각 = 45.5, 227, 455 N 10, 20 kDa의 선형 PEG 사용) 로머에 반복합니다. R1 RN 행 : 아미노산 측쇄. PGN에 PG1 : 그룹을 보호하는 사이드 체인. TFA : 트리 플루오로 아세트산. 팁 : 트리 이소 프로필 실란. DODT : 3,6 – 디 옥사 -1,8 – octanedithiol. H 2 O : 물.
마이크로파를 이용한 메타 크릴 화의 방법은 최근 중합체 및 중합체의 다양한 네트워크에 펩티드 결합을 용이하게하는 메타 크릴 기 (도 3b)와 함께 펩티드의 N-말단을 기능화하는 단체에 의해 채택되었다. 이 반응에서, 펩티드의 N-말단의 차 아민 아미드를 형성하는 메타 크릴 산 무수물에 카본 원자와 반응한다. 이 부생 메타 크릴 산, 메타 크릴 관능 펩티드를 생성한다. 펩티드 서열의 N-말단을 기능화이 절차를 사용할 때, 반응성 측쇄 (급 아민 (리신), 알콜 (세린, 트레오닌) 및 페놀 (티로신))를 포함하는 아미노산은 기능화 도중 보호하는 것이 중요하고, 보호 그룹은 메타 크릴 설립 후 절단됩니다.
이 문서에서는 이러한 전자 레인지, 모두를 설명 할 것이다PEGDM를 합성하고 온 수지 펩타이드 서열을 기능화, 일반적인 함정을 강조하고 문제 해결 방법을 제안하는 방법 번가 보조. 이 기사에서는 일반적으로 제품의 작용을 평가하기 위해 사용되는 분석 화학 기술을 수행 할 수있는 방법을 상세하게 설명하고, 고급 수정을 수행하기위한 제안과 자원이 주어집니다. 전형적인 결과, 하이드로 겔 네트워크를 형성하기 위해 합성 PEGDM을 사용하여 모델 약물의 방출을 제어하기 위해 형성된 하이드로 겔을 이용하고, 휴대 하이드로 겔의 상호 작용을 촉진하기 위하여 기능화 된 펩티드를 이용하는 포함하는 입증 될 것이다. 특별한주의 하이드로 겔 메쉬 크기의 특성 및 하이드로 겔 조성물이 차례로 같은 강성 약물 방출 프로파일과 대량 재료의 특성을 제어이 기본 물리적 속성을 영향을 튜닝 할 수있는 방법을 논의에 지급됩니다.
이전에 설명 된 방법은 PEGDM의 합성 펩티드 또는 다른 아민 함유 화합물의 메타 크릴 작용에 대한 귀중한 있습니다. 이들 재료는 재생 의학 및 약물 전달 애플리케이션에 사용될 수있다. 인해 PEG의 친수성 특성으로 PEG 로머로부터 형성된 하이드로 겔은 몸이 많은 조직과 유사한 높은 물 함량이. 이 품질은 PEG는 단백질 흡착에 매우 저항하는 몸 3 따라서 불활성 있습니다. 그러나 PEG의 흡습성이 작용하는 동안 성가신 증명할 수 있습니다. 물을 메타 크릴 화 절차 중에 PEG 샘플에서 존재하는 경우, 메타 크릴 산 무수물, 메타 크릴 산을 생산하는 물과 우선적으로 반응하고, PEG의 불량 작용이 발생할 것이다.
그러므로, PEG 또는 메타 크릴 화 펩티드의 성공을 보장하기 위해 취할 수있는 가장 중요한 단계 중 하나는 무수물을 유지하는 것이다루스 반응 조건. 사용 전에 모두 유리를 건조 추천 단계는 수질 오염을 방지하기위한 것이다. 샘플에서 물의 존재는 1.7 ppm 이하 브로드 피크 (도 4)로, NMR 분석에서 볼 수있다. 별로 메타 크릴 화 심지어 모든 유리 제품을 건조 후 관찰되는 경우, 화학 물질을 황산나트륨 또는 사용하기 전에 다른 건조제 (분 자체 등)상에서 건조 될 수있다. 증류로는 사용하기 전에 물을 제거 및 메타 크릴 산 무수물을 정화하는 데 사용할 수 있으며, 공비 증류는 PEG (23)를 건조 할 수있다. 극단적 인 경우, 합성은 더욱 적절히 무수 조건을 위해 글로브 박스에서 수행 될 수있다. 동일한 절차에 따라, 메타 크릴 화의 두 번째 라운드는 또한 작용을 높이기 위해 수행 될 수있다. 작용의 추가 라운드가 요구됩니다 가능성이 항상 있기 때문에, 치료는 신속하게 진공 여과에 의해 PEGDM를 수집하는 단계 1.7 및 1.9에주의해야한다. 이상 진공 여과 물 흡착을위한 기회를 증가하고, 공기 PEG의 절대적으로 필요한이 증가 노출입니다.
하이드 록시 작용기에 무수 메타 크릴 산의 비율 초과가 PEG 전구체에 PEG의 작용 (예를 들어, 암 #)를 증가, 변경되지 않은 상태로 유지하더라도 일반적으로 달성 %의 작용의 감소 (게시되지 않은 결과 브누아 연구소)와 연결되어 있습니다. 특히 어려움이 충분히 높은 기능화 달성 발생하는 경우 선제 작용 효율의 감소를 해결하기 위해, 또는, 마이크로파 반응의 지속 기간이 증가 될 수 있고, 마이크로파 간격이 30 초를 유지하는 것을 조건. 10 몰 과량 일반적 충분하지만, 반응에 사용 된 메타 크릴 산 무수물의 양은도 12를 달성 퍼센트 작용을 증가시키기 위해 증가 될 수있다.
그것은 중요하다추가 침전 단계 (1.9)는 양호한 NMR 신호를 얻기 위해 수행 될. 그것은 재침 과잉 메타 크릴 산 무수물과 메타 크릴 산의 제거를 돕기 위해 발견되기 전에 밤새 샘플을 건조, 합성으로 당일 제 침전을 수행하도록 유혹된다. 시료 준비는 깨끗 NMR 스펙트럼을 달성하는데 중요하며, 따라서 샘플이 추천하는 조건을 사용하여 제조. 4 올바르게 작용 PEGDM위한 대표적인 1 H-NMR 결과를 보여도한다. 중앙 PEG의 양성자 단자 크릴 양자의 비율을 분석함으로써 PEGDM 적절히 작용로 측정되었다. MALDI 샘플 준비는 명확한 독서를 달성하기위한 마찬가지로 중요합니다. MALDI는 염 및 높은 샘플 농도의 존재에 특히 민감하다. (하이 신호 50 임의 단위 (AU 상기 강도) : 노이즈 비율) 판독 클리어 MALDI이 경우 얻을 수없고, 샘플의olution 매트릭스 솔루션과 결합하고 다시 분석하기 전에 MALDI 용매에서 1:100으로 희석해야한다. 5 올바른 펩타이드 작용, 절단 및 샘플 준비 후 대표 MALDI-TOF 결과를 보여줍니다 그림. 종래 기능화 (도 5a)에 대한 수지의 작은 샘플의 단리는도 5b에 도시 된 펩타이드의 올바른 크릴 기능화와 펩티드 GKRGDSG의 정확한 합성을 나타낸다.
온 수지를 펩티드의 작용은 비교적 견고 절차 동안, 각 시퀀스에 필요한 절단 조건은 종종 조정을 필요로한다. 많은 아미노산 측쇄 (긴> 30 아미노산 또는 보호기를 가진> 15 아미노산)를 보호 한 긴 서열의 경우, 절단의 기간이 한 시간이 증가되어야한다. 절단 시간이 너무 많이 확장 된 경우에는, 펩타이드 결합의 절단으로 인해 장기 산성 노출 될 수 있습니다. MALDI 아나 용해는 펩타이드 합성 또는 분해에서 발생한 오류를 공개에 매우 도움이 될 수 있습니다. 예상 분자량 아래의 관찰 감소는 아미노산 (들) 몇 제대로하지 않았다 표시 할 수 있습니다, 또는 그 펩타이드 분획은 (분자량이 일반적으로 관측 된 변화의 소스에 대한 표 2 참조)가 발생했습니다. 관찰 된 분자량 사용한 보호기의 무게에 의해 예상보다 높은 경우에, 절단 및 탈 보호가 불충분하고 펩티드 추가적인 시간 recleaved되어야한다는 것이다.
아미노산 삭제 | MW 변화 (g / 몰) | Uncleaved 보호 그룹 | X; "> MW 변화 (g / 몰)일반적으로 존재하는 이온 | MW 변화 (g / 몰) | |
알라 | -71 | 아세틸 | +42 | CL – | +35 |
인수 | -158 | 알릴 | +40 | K + | +39 |
ASN | -114 | 할당 | +85 | MG 2 + | <TD 스타일 = "너비 : 64px;"> +24|
미루 나무 | -115 | BOC | +100 | + 나 | +23 |
CYS | -103 | 고체상 합성 | +223 | ||
GLN | -128 | OtBu | +56 | ||
글루 | -129 | PBF | +252 | ||
GLY | -57 | tBu에 | +56 | ||
그의 | -137 | TRT | 242 | ||
일 | -113 | ||||
레우 | DTH : 64px; "> -113|||||
리스 | -128 | ||||
만난 | -131 | ||||
반페 | -147 | ||||
-97 | |||||
SER | -87 | ||||
THR | -101 | ||||
TRP | -186 | ||||
-147 | |||||
발 | -99 |
표 2. 일반적으로 펩타이드의 분자량의 변화를 관찰했다.
전자 레인지를 이용한 메타 크릴 화 방법을 사용하여 생산 로머는 재생 의학, 약물 전달 응용 프로그램의 숫자에 사용할 수 있습니다. 여기에 합성 작용 펩티드 및 PEGDM는 질산화물 매개 중합 (NMP), 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP) 또는 가역 Addi의를 사용하여 폴리머에 통합 할 수 있습니다기 – 분할 전송 (RAFT) 방법 24. 이전의 Khetan 및 버딕 22 조브 문서에서와 같이 겔 네트워크는 또한, 세포의 존재하에 제조 할 수있다. 단독 PEG 몇몇 세포 유형 (25)의 생존과 기능에 중요한 세포 물질의 상호 작용을 제공하지 않기 때문에 이것은 종종 그러한 RGD 또는 세포 외 매트릭스 분자와 같은 세포 접착 펩타이드의 결합을 필요로한다. 펩타이드는, 예를 들어, 기존의 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성 및 하이드로 겔 네트워크에 내장 할 수 있도록 여기에 설명 된 것처럼 작용 될 수있다. 도 6, 하이드로 겔 (0.5 ㎜)가 부착 된 수와 확산 셀 (도 6b의 증가, PEG 하이드로 겔 표면에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)의 부착을 용이하게 소재 크릴 기능화 세포 접착 펩타이드 GK RGDS G의 포함 된 바와 같이 ), PEG 비교 (세포 접착 펩타이드없이 하이드로 <str사연>도 6a). 그러나, 이전의 연구는 세포 물질의 상호 작용이 더 펩타이드 인테그린 입체 장애를 줄이기 위해, 접착 펩타이드 하이드로 겔 네트워크 사이에 3,400 다 PEG 스페이서 포함하여 향상된 것을 보여 주었다. 스페이서 포함하지 않고, 세포가 아니라 펩티드 (26) 인테 매개로 상호 작용을 통해보다 펩타이드에 흡착 특이 단백질을 통해 PEG 하이드로 겔와 상호 작용을 할 수있다. 이 PEG 스페이서를 통합하고 비특이적 상호 작용을 방지하기 위해, 펩티드는 왜가리와 허벨 (26)에 의해 설명 된대로, N-히드 록시 숙신 활성화 에스테르를 통해 PEG를 monofunctionalized에 접합 될 수있다.
하이드로 겔 네트워크의 응용 프로그램은 재료의 특성에 엄격한 제어를 필요로합니다. PEG 하이드로 겔에 중요한 이점은 이러한 속성을 제어 높은 수준이다. 예를 들어, 분자량은, 수, 팔 및 PEG의 중량 %는 하이드로 겔 네트워크의 형성에 사용은-술통 미세하도록 변경 될 수있다특정 응용 프로그램에 대한 전자 속성. 이 하이드로 겔 메쉬 크기에 엄격한 제어 하이드로 겔 팽윤 율 (Q)과 강성 (탄성 계수, E)을 제어 (ξ)를 할 수 있습니다. 이는도 7a에 도시 된도 8, 정량화 곳 하이드로 겔 메쉬 크기의 증가 (도 8a) 및 하이드로 겔 강성 (도 8b)의 감소 PEG 로머 분자량 결과를 증가시킨다.
이러한 하이드로 겔 네트워크에서 대량 동작을 제어하는 기본 물리적 특성은, 메쉬 크기는 플로리 – Rehner 보낸 식 (16)을 사용하여 계산됩니다. 이 계산을 수행하기 위해, 체적 팽윤 율 (Q)는 우선 수학 식 4로부터 계산된다 :
(4)
ρ의 물의 밀도 (1 ㎍ / ㎖)이고, ρ (P)는 PEG의 밀도 (이다1.12 ㎍ / ㎖), M의 하이드로 겔 및 M D의 부어 질량 (자주) 동결 하이드로 겔의 동결 건조 후 측정 된 하이드로 겔의 건조 질량입니다. 가교 (M ℃, 소재 g / 몰) 사이의 분자량은 다음 수학 식 5로부터 계산된다 :
(5)
M은 N (g / 몰 소재) PEG의 수 평균 MW이고, 중합체의 체적이다 , V 1은 물의 몰 부피 (18 ㎖ / 몰)이고, V 2는 하이드로 겔의 평형 중합체 체적 분율
( ) 및 X 1 </서브> 중합체 – 용매 상호 작용 PEG에 대한 매개 변수 및 물 (0.426) 16. 가교 (N) 사이의 결합의 수는 다음 식 (6)으로부터 계산된다 :
(6)
N B는 PEG 반복 채권의 번호입니다 (3)과 M의 R은 PEG 반복 (44 G / mol)을 27 MW이다. 이를 통해 고분자 사슬의 제곱 평균 종단 간 거리 (뉴 멕시코에서) 식 (7)로부터 계산한다 :
(7)
난 (CC 및 CO의 결합 길이를 기준으로 계산 0.146 nm의)의 평균 결합 길이와 C의 n은 폴리머 (PEG에 대한 4.0) (28)의 특성 비율입니다. 인터넷nally, 하이드로 겔의 메쉬 크기는 수학 식 8로부터 계산 될 수있다 :
(8)
하이드로 겔 성질은 유사 하이드로 겔의 형성에 사용되는 PEG의 양을 조정함으로써 조정될 수있다. 이어서 하이드로 겔 강성을 감소 하이드로 겔 메쉬 크기가 증가 PEG 로머 결과의 중량 백분율을 감소.도 7b는 예시 및도 9는 PEG의 중량 %가 메쉬 크기를 제어하는 데 사용될 수있는 하이드로 겔 형성에 사용하는 방법을 정량화 (도 9a) 및 결과 하이드로 겔 강성 (그림 9B). 기판의 강성이 같은 줄기 세포의 분화 29과 같은 세포 행동에 영향을 도시 한 바와 같이, 단단하게 강성을 제어 할 수있는 능력은 하이드로 겔의 제조에있어서 중요한 특성이다.
히드로 겔은 CONTR에 이용 될 수있다올 약물 전달. 도 7a에 도시이어서 캡슐 형 약물, 소 혈청 알부민 (BSA)의 방출을 증가 하이드로 겔 네트워크의 메쉬 크기를 증가 PEG 로머의 분자량이 증가하는,도 10에서와 같이. 이 연구에서 하이드로 겔 샘플 메쉬 크기 계산을위한 하이드로 겔 습식 및 건식 질량의 측정을 할 수 있도록 T = 1백95시간에 파괴되었다 있지만, 그것은 샘플이 긴 시간 동안 배양했다 BSA의 방출이 발생합니다 계속 우리의 경험이다. 다른 그룹은 또한 BSA는 PEG 하이드로 겔 네트워크 (30) 내에서 확산에 내성이 있음을보고 한대로 그림 10에서 관찰 BSA의 불완전한 버전은, 예상하지 못한 것입니다. 캡슐화 된 단백질의 불완전한 출시로 인해 단백질과 PEG 로머, 또는 PEG와 BSA 31 라이신 잔기에 차 아민 그룹의 메타 크릴 레이트 그룹 사이에 공유 결합과 수소 결합에 발생할 수 있습니다 </s업>. 또한, BSA는 효과적인 스톡스 반경을 증가하고 하이드로 겔로부터 방출을 방해 할 수있는 시간이 지남에 따라 집계 및 이황화 결합 형성하는 경향이있다. 이와 PEGDM의 히드로 겔과 같은 사슬 성장 하이드로 겔은,, (그림 2A) 네트워크 비 이상성 (nonideality) 및 이종 하이드로 겔 메쉬 크기 경향이있다, 그것은 캡슐화 된 BSA의 일부가 훨씬 작 메시가 하이드로 겔의 영역에 포함하는 것도 가능하다 그것의 방출을 방지 젤 내에서 전체 평균보다 크기입니다. 캡슐화 된 BSA의 불완전 nonFickian 동의서 (데이터가 표시되지 않음)이 경우에 관찰 있지만, 인슐린, 알부민 등의 수많은 다른 모델 약물의 제어 Fickian 릴리스 유사한 PEGDM 30을 하이드로 겔 사용하여 증명되었다. 또한, 왓킨스와 Anseth 비슷한 하이드로 겔의 형광 분자의 방출을 보여주기 위해 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용했다가 Fickian 확산과 수용 가능한 모델로 나32 thods.
이 연구에서 형성된 하이드로 겔은 비 분해성 있지만, 네트워크 열화에 혼입하고 이러한 네트워크 내에 동조 될 수있는 또 다른 파라미터이다. 제어 하이드로 겔 저하에 제공하는 것은 세포 행동 (33), 조직의 성장 또는 호스트 조직 내 성장의 촉진, 또는 편의 적출 (34)의 필요성을 제거에서 변경 될 수 있습니다. 분해 PEG 하이드로 겔은 일반적으로 35 메타 크릴 화 이전에 PEG 내 수산기 상 개환 가수 분해 D, L-락 타이드 글리콜 라이드, 또는 ε-카프로 락톤 그룹에 의해 합성된다. 이들 세 개 글리콜 에스테르 인해 그들의 다양한 소수성에, 최대 락 티드 이어 분해 감수성, 및 카프로 락톤 에스테르를 갖는, 에스테르 작용기의 가수 분해에 의해 분해. 가수 분해성 기의 혼입 후, PEG는 또한 메타 크릴 화 절차를 이용하여 작용 화 detaile 수이후 라디칼 개시 사슬 중합 (36, 37)를 통해 하이드로 겔 네트워크 형성을 가능하게이 문서에서 D. 하이드로 겔 네트워크의 열화의 속도는 가수 분해성 기 (글리콜 라이드, 락 티드 등)의 신원을 변화시킴으로써 및 구조에 통합 35,38 분해성 반복의 수를 변경함으로써 제어 할 수있다.
이론적으로, 여기에 설명 된 방법은 각각의 단계 1.3 및 3.3에 아크릴 무수 메타 크릴 산 무수물을 대체하여 PEG와 펩타이드의 아크릴화에 사용될 수 있습니다. 그러나, 아크릴 무수물은 훨씬 적은 매력 전자 렌지를 이용한 메타 크릴 화보다 전자 레인지를 이용한 아크릴화를하고, 무수 메타 크릴 산 39, 40의 20 배 이상 비용입니다.
우리는이 절차의 효율성을 평가하는 방법을, PEG와 펩티드를 기능화하는 간단한 신속한 방법을 설명하고, U에 대해 그 준하이드로 겔 네트워크를 형성하도록 합성 재료를 부른다. 이러한 합성 도구는 응용 프로그램에서 매우 다양한 있으며, 약물 전달 및 재료 연구 실험실의 수의 주식을 증명해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 / 로체스터의 대학과 정형 외과 연구 및 교육 재단 / 근골격계 이식 재단 (OREF에서 박사 다니엘 벤와에게 제공 시작 펀드, 하워드 휴즈 메드 -에 – 졸업생 교제 (AVH)에 의해 부분적으로 투자되었다 MTF). 저자는 자신의 장비의 사용에 박사 제임스 L. 맥그래스에게 감사의 말씀을 전합니다.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |