JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50796
, , ,
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics,University of California, San Diego

Summary

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

Abstract

Yaklaşık 30 yıldır, bilim adamları, glikoz 1-9 uyarımı takiben insan C-peptidi dolaşan önemli bir artışla kanıtlandığı gibi çıplak farelerin böbrek kapsülü altından nakledilen insan fetal SKK, endokrin hücreleri saptanmıştır olgunlaşarak olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte in vitro olarak insan fetal ICCS insülin üreten hücrelerin oluşumu düşük 10; insan embriyonik kök hücreleri (HESC) ile yapılan son deneylerin sonuçları andıran, tip 1 diyabet için potansiyel bir terapötik tedavi olarak çok ümit vericidir hücreleri, yenilenebilir bir kaynak. ICCS gibi, kısmen farklılaşmış HESC nakli glikoz duyarlı, insülin üreten hücreleri üretmek, ancak HESC insülin üreten hücrelerin in vitro oluşumunda çok daha sağlam 11-17 olduğunu. Endokrin öncü hücrelerin büyümesini ve farklılaşmasını etkileyen faktörlerin tam bir anlayış olası veri ICCS ve o hem üretilen gerektirecektirSC. Protokoller bir dizi in vitro 11-22, SKK, 10,23,24 için çok daha az varoldukları için de HESC insülin üreten hücreleri üretmek için var iken. Bu tutarsızlık parçası muhtemelen insan fetal pankreas ile çalışma zorluğu geliyor. Bu amaç doğrultusunda, biz değişen gebelik yaşı insan fetal adacıklar pankreaslarından izole etmek için mevcut yöntemler üzerine inşa etmek için devam 12 ila 23 hafta, bir tek tabaka veya süspansiyon içinde hücrelerin büyümesi ve hücre proliferasyonu, pankreas belirteçler ve insan hormonlar için görüntü glukagon ve C-peptid de dahil olmak üzere. SKK taze doku naklinden 6 ile elde edilen C-peptid seviyeleri ile benzer olan çıplak farelerin böbrek kapsülü altında transplantasyonundan sonra C-peptid açıklamasında sonucunda, aşağıda tarif edilen protokole göre üretilen. Burada yer alan örnekler, pankreatik β endoderm çoğalması ve hücre oluşumu üzerine odaklanmak, ancak protokol pankreas geliştirme diğer yönlerini incelemek için kullanılabilecektir, Ekzokrin, duktal ve diğer hormon üreten hücreler de dahil olmak üzere.

Introduction

Tip 1 diyabette hücre bazlı ensülin değiştirme tedavileri için bir birinci sınırlama nakli için insan adacık yetersizliği olan. Bir insülin eksikliği devlet metabolik ihtiyaçlarını karşılamak insülin üreten hücrelerin, insan pankreatik ön madde hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını düzenleyen yeteneği, tip 1 diyabet tedavisi için hücre bazlı bir tedavi için çok önemli bir yapı taşıdır kalır.

HESC türetilmiş insülin üreten hücrelerin, insan fetal endokrin pankreas hücreleri veya bunların öncülerinin gelişi klinik nakli için hücrelerin olası kaynağı olarak görüldü kadar. Bilimsel ve düzenleyici manzara son birkaç yıl içinde değişmiş olsa da, insan fetal pankreas geliştirir anlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Çoğu artık hücreleri genişletmek için etkin ve güvenilir bir yöntem kurulmuştur halinde olası Bununla birlikte, bu hücrelerin tedavi amaçlı kullanımı olabilir ag insan fetal hücrelerin tedavi amaçlı kullanım elaraştırılmalıdır ain. Geriye kalan diğer bir önemli engel daha duyarlı glikoz içine insan fetal pankreas hücreleri agrega (SKK) in vitro dönüşüm içinde, endokrin salgılayan hücreler insülin şu anda verimsiz bir süreç olmasıdır. Çok iş fazla yaklaşık 30 yıldır açıklanmış ve endokrin pankreas gelişimi için gerekli transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarını tarif olmasına rağmen, boşluklar transkripsiyon faktörlerinin geçici ekspresyonu düzenlenmiş ve hücre fonksiyonu ile ilgili olduğunu hakkındaki bilgi orada kalır.

HESC türetilmiş insülin üreten hücrelerin, insan fetal endokrin pankreas hücreleri veya bunların öncülerinin gelişi klinik nakli için hücrelerin olası kaynağı olarak görüldü kadar. Bilimsel ve düzenleyici manzara son birkaç yıl içinde değişmiş olsa da, insan fetal pankreas geliştirir anlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Birçok şimdi, ancak eğer etkili olası gibi insan fetal hücrelerin terapötik kullanımını görüntüleyebilirve hücreler kurulmuştur genişletmek için güvenli bir yöntem, bu hücrelerin tedavi amaçlı kullanımı daha araştırılabilir. Geriye kalan diğer bir önemli engel daha duyarlı glikoz içine insan fetal pankreas hücreleri agrega (SKK) in vitro dönüşüm içinde, endokrin salgılayan hücreler insülin şu anda verimsiz bir süreç olmasıdır. Çok iş fazla yaklaşık 30 yıldır açıklanmış ve endokrin pankreas gelişimi için gerekli transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarını tarif olmasına rağmen, boşluklar transkripsiyon faktörlerinin geçici ekspresyonu düzenlenmiş ve hücre fonksiyonu ile ilgili olduğunu hakkındaki bilgi orada kalır.

Son zamanlarda, kök hücre alan olgun endokrin hücre işaretçileri eksprese eden hücrelerin üretimini sürmek için doku adacığı gelişimi sırasında zamansal transkripsiyon faktörü ifadesi ile ilgili bilgi birikimi uygulamaktadır. HESC ve uyarılmış pluripotent hücreler (iPSC) insülin üreten hücrelerin oluşumu önemli yapılan ve rağmen- bir sözde "kara kutu bunu takiben de 2, pankreas ön-madde transkripsiyon faktörleri) nakli sonrası in vivo olgunlaşma ifade eden hücreleri üretmek için 1) erken in vitro farklılaşması: son yıllarda önemli gelişmeler, en etkili protokolleri, iki ayrı faz farklılaşması gerektirir "dönemi. Ileriye taşımak için, ne olursa olsun hücre kaynağı, bir biyokimyasal düzeyde anlaşılması gerektiğini, in vivo biyoloji yatan adacık olgunlaşmasını anlamada ilerler. ICCS ve HESC ile elde edilen sonuçlar arasındaki benzerlik, in vitro olarak, olgun, glikoz cevap veren, insülin salgılayan hücrelere ön-madde insan pankreas hücrelerinin geçiş düzenleyen önemli bir biyokimyasal süreçlerin bir dizi bilinmemektedir olduğunu göstermektedir. Bu anlayış merkezi bir kısmı pankreas progenitör hücrelerin fonksiyonel endokrin hücre popülasyonlarının türetmek için yeni yöntemler geliştirmek olacaktır ve HESC biyokimyasal yak sadece gerektirirdeğişiklikleri analiz olgunlaşma olayları, ancak yöntemleri aydınlatmak oaches.

Neden insan fetal pankreas hücreleri görüntüleme adacık olgunlaşmasında değişikliklerin belirlenmesi kritik bir yönü olduğunu inanıyor musunuz? Cevap insülin üreten hücreleri üretmek için tarihsel arayış içinde kısmen yatıyor. Pankreas öncüleri ve adacıktan için model ve doku kültürü sistemleri, hem araştırmacılar, in vitro hayvan ve insan adacık adacık olgunlaşma arasındaki mevcut önemli farklılıkları keşfetmek için izin vermiş. Insan fetal pankreas gelişim keşif için bir sınırlama yasal olarak kullanılabilir gebelik yaşları sadece heterojen hücre agrega yol vermesidir. İzole edilmiş fetal insan hücreleri adacıklar, boyama, gebelik yaşı 9-23 hafta in vitro kültür sonra en az% 15 en adacık hücreleri, hormonlar için boyama ile değil, endokrin hücreleri için belirteçler içerir ortaya koymaktadır, ancak benzer. Bununla birlikte, transplantasyon sonrası veolgunlaşmasını vivo, hücrelerin büyük bir çoğunluğu endokrin belirteçler 6,25 ifade eder. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar in vitro farklılaştırma sonra hormon pozitif hücre popülasyonlarını arttırmak için. In vitro yöntemler muhtemelen in vivo adacık fikir verecektir sadece tek hormon pozitif endokrin hücreleri mütevazı nüfusu üretebilir HESC farklılaşma protokolleri bugün yankılandı ediliyor olgunlaşma. Dahası, insan fetal pankreas gelişimini sürücü moleküler olayları anlamaya olasılıkla HESC insülin üreten hücreleri elde etmek ve daha fazla β hücre yenilenmesini ve pankreas hücre transdiferansiasyon düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için çabalarını artıracaktır.

Insan fetal pankreatik hücre ve HESC olgunlaşma arasındaki benzerlikler hücre fonksiyonu için uzatılabilir. Murin hücreleri gibi insan fetal hücreleri ve farklı HESC hem glikoza tepki olarak insülin serbest bırakmak için mümkün değildirin vitro 26,27 doku adacığı neoformasyon sonra. Bununla birlikte, çıplak farelerde ve olgunlaşması, hem insan adacık benzeri kümeler ve HESC sergi bir endokrin fenotip türetilmiş insülin üreten hücrelere nakli üzerine. Üç ay aşılama sonra, nüfus birinden nakledilen hücrelerin hemen hemen% 90 insülin pozitif, ve C-peptid 17,26 serbest bırakılması tarafından belirlenen normal işlev. Bu sonuçlar transplantasyonu, adacık olgunlaşmasını teşvik bağlam ve tanımlanamayan ipuçları sağladığını göstermektedir. Örneğin insan fetal pankreas hücreleri olgunlaşma modüle ve hızlandırmak faktörleri belirlemek için arama yardımcı olacak için, burada açıklanan biri olarak optimize görüntüleme protokolleri,. Gelişme bu aşamada bir endokrin hattına doğru farklılaştırılmış insan fetal pankreas hücreleri ve HESC Temel biyokimyasal keşif olgunlaşma verimliliğini ölçmek için gereklidir.

Figür özetlenen Aşağıdaki protokol,e 1, bu hücrelerin bütün insan fetal pankreas ve görüntüleme ikinci SKK adlandırılan insan fetal pankreas hücrelerinin izolasyonu için mevcut bir yöntem sağlar. Bu protokol daha sonra bir tek tabaka ya da süspansiyon halinde yetiştirilebilir dokudan hücrelerin bir ilk hazırlanmasını gerektirir. Endokrin hücresi çoğalması ve olgunlaşması ve yaygın olarak kullanılan belirteçlerinin görüntüleme için hücrelerin hazırlanması tarif edilmektedir.

Kimyasal modifiye ajanlar çeşitli yokluğunda veya varlığında, üretimi ve ICCS görüntüleme kültür koşulları ve tam olarak işlevsel ekzokrin, duktal, ya da, insan fetal pankreatik hücrelerin maturasyonu bileşiklerin belirlenmesi için, transplantasyon modelleri ile karşılaştırıldığında hızlı bir yöntem sağlar hormon pankreas hücrelerinin üretilmesi.

Protocol

Başlamadan önce Notlar: Insan fetal pankreası Doğum Kusur Research Laboratory, doku hasat University of Washington (Seattle, Washington, ABD) elde edilmiştir. Numunelerin doku bağışı, depolama ve kullanım için bilgilendirilmiş onam merkezi tarafından donörlerden elde edilmiştir. Protokol rıza beyanı yazılı olarak sunulan ve Kaliforniya Üniversitesi, San Diego İnsan Araştırma Koruma Programı bütün çalışma (Protokol # 081237XT) kabul edildi. Bu insan fetal pankreas ve tüm prosedür sırasında buz üzerinde pankreas tutan kabı hem de korumak için gereklidir. Ayrışma ve sindirim mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Insan fetal pankreas depolama ve pankreas taşınması için tampon elde edildi klinik gönder. (RPMI-1640 +% 10 normal insan serumu (NHS), 300 mM trehaloz SG, penisilin / streptomisin ve fungizon). İnsan Fetal Pankreas 1. Diseksiyon 2.5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon vermek üzere HBSS RT kolajenaz XI', 5 mg çözülür. 4 ° C'de steril (otoklav) sintilasyon şişesine ve deposuna bir 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu sterilize Bir doku kültürü kaputu, 2 steril Petri kapları, steril küçük pota (bir pota kullanılamaz ise, küçük bir bardak ikame edilebilir), sterilize makas ve forseps yola. Pankreas yıkamak için bir Petri kabı 2 ml HBSS ekleyin. Yaklaşık 1 ml bırakarak fetal pankreas içeren tüp aspire sıvı. HBSS'nin olmadan 60 mm Petri kabı içine forseps ile pankreas kaldırmak. Bu deneyler için, fetal SKK, 9 ila 23 hafta arasında değişen, gebelik yaşı taze pankreastan oluşturulur. Daha önce gestionational yaşlarda pankreastan izolasyonu nedeniyle pankreas boyutuna zordur. Protokol 23 hafta, p ancak satın ötesine gestasyonel yaşları muhtemelen geçerlidirancreata Bu saatten sonra, çünkü federal (US) kısıtlamaları zordur. Bazen, fetal pankreas dalak, yağ, ya da orijinal diseksiyonu bağlı bağ dokusu ile geldi. İlave doku, çıplak gözle kolayca görülebilir ve protokolü başlamadan önce pankreas çıkarılmalıdır. Petri kabındaki soğuk HBSS (~ 0.5 mi) bir minimal hacimde pankreas durulayın. Bir buz kovası steril forseps ve yer kullanarak küçük steril potaya temizlenmiş pankreas taşıyın. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü için bir tutucuya yerleştirin ve pota, makas 2 çiftleri kullanılarak, kuvvetli bir şekilde birkaç dakika pankreas dilim. (Genellikle 2-5 dakika, ancak zaman dokusunun boyut ve sertlik bağlıdır). Kesme tekniği önemlidir. Sadece karşıt hareket eden kolları sabit bir pozisyonda makas bir şekilde tutun. Makas uçları krozenin dibine üzerinde olmalıdır. Küçük içine pankreas kırmak için hızlı makas hareketi ile devamadettir. Doku parçaları kadar küçük olursa, o kadar iyi kolajenaz çalışacaktır. Kadar 10 dakika boyunca 200 rpm'de 37 ° C bir su banyosu çalkalama kümesindeki kolajenaz ve yeri ihtiva eden şişeye HBSS + kıyılmış pankreas 1.5 ml ilave edilir. Ilk 5 dakika boyunca daha sık birden kontrol etmeyin. Sindirim süresi, doku kalitesine bağlıdır, az 6 dakika kadar yeterli olabilir. Parçacıkların küçük ve homojen ise bitiş noktasıdır. Kollajenaz aktivitesini durdurmak için soğuk HBSS flakon (10-15 ml) doldurun. Buz üzerine yerleştirin ve 10 dakika için kümeleri yerleşmek için izin verir. Genellikle bu noktada, bazı hücre ölümü meydana geldi ve DNA ortama salınır. Bu medya kılçıklı 'yapabilir; Bu durumda, söz konusu çözeltiye 100 ul DNase (10 mg / ml stok) ilave edilir. Sintilasyon flakon doku (7-8 ml) hafif yarısı dolu daha az bırakarak üst tabakası kapalı 10 dakika, aspiratı için yerleştikten sonra. Bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın, 5 ml HBSS ekleyin. 300 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. HBSS aspire ve RPMI-1640, Glutamax,% 10 normal insan serumu (NHS), 10 mM HEPES pH 7.2, penisilin / streptomisin ve fungizon içeren 5 ml ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 60 mm Petri kabı üzerinde Plate. Β hücreleri üretmek için çalışıyoruz araştırmacılar için, medyaya HGF (10 ng / ml nihai) ekleyin. Buna ek olarak, grup bir dizi iç salgı bezi hormonu GLP-1 ile kültür ortamı ilave da β hücreleri 28 artırdığını göstermiştir. Hücreler ÜAK'lerin toplam ve oluşturulması için 72 saat boyunca süspansiyon içinde bırakılmalıdır. Süspansiyon 72 saat sonra, hücreler daha önce tarif edildiği gibi 29, insan hücre hattı HTB9 matrisinin matris üzerine kaplanabilir. Ne olursa olsun büyüme koşulları içinde, ortam her 48 saat değiştirilmelidir. Süspansiyon Yetiştirilen ICCS Endokrin Hücre çoğalması ve olgunlaşması belirteçleri 2. İmmünofloresan Tek tabakalı veya cam lamelleri Hücre çoğalmasını ölçmek için, süspansiyon içinde yapışık hücreler veya hücre ya BrdU etiketleme önce PFA tespiti için 12 saat boyunca gerçekleştirilir. BrdU reaktif 1:100 inceltilir ve RPMI-1640 içinde steril filtre Glutamax,% 10 NHS, 10 mM HEPES pH 7.0, penisilin / streptomisin ve fungizon. Süspansiyon hücreleri için: 300 x g ve aspirat kültür ortamı 5 dakika boyunca santrifüjleyin. 300 xg ve aspirat az 5 dakika boyunca, santrifüj ÜAK'lerin yıkamak için 10 ml PBS ilave edin. SKK, parafin gömülü olacak ise, isteğe bağlı protokol 3,1-3,17 takip edin yapışık hücreleri için:. Kültür ortamı çıkarın ve yukarıda açıklandığı gibi PBS ile hücreleri yıkayın. Daha sonra PBS ile iki kere yıkayın, oda sıcaklığında% 4 PFA ile 20 dakika boyunca, hücreler. Bu noktada, plakalar Parafilm ile sarılmış olabilir ve en fazla 1 hafta boyunca 4 ° C'de PBS içinde depolanır. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton-X-100 ile inkübe hücreleri. PBS ile iki kez yıkanır ve hücreler Bloklama Tamponu uygulanır (% 2 donTuş serumu,% 2 sığır serum albümini, 1 saat boyunca PBS) içerisinde seyreltilmiş 50 mM glisin. (Tampon 1:10 seyreltilmiş Engelleme) Çalışma Tamponu ile hücreleri yıkayın. Çalışma tamponu içinde antikor seyreltin. Cam kapak slipleri üzerinde yetiştirilen hücreler, 60 ul toplam hacim içinde antikor seyreltin. 6-çukurlu tabak hücreleri için, 600 ul toplam hacim içinde antikor seyreltin. Çoklu epitop leke için, antikor bir kokteyl tatbik edilebilir. Bir kontrol olarak, IgG kullanımı veya belirli bir antikor yerine immün serum pre. Birincil antikor olarak kullanılan Kontrol numuneleri aynı türden kontrol IgG ile inkübe olması gerekir. 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N C'de 1.5 saat ya da birincil antikor inkübe Birincil antikor aspire ve oda sıcaklığında Çalışma Tamponu ile 3 kez yıkayın. Alexa konjuge antikor için 1:1000 – Rhodamine ve FITC konjuge antikor, 1:500, 1:200 için de ikincil antikor seyreltin. Tüm ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kapak örneklerisinyal kaybını önlemek için bir alüminyum folyo içinde. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: çekirdekleri görselleştirmek için, DAPI ikincil inkübasyon sırasında 1:500 eklenebilir. Bu durum toplam hücre popülasyonunda protein ekspresyonunun ölçülmesi için yararlıdır. İkincil antikor aspire ve oda sıcaklığında Çalışma Tamponu ile 3 kez yıkayın. Tampon dalmış iken bir lamel yetiştirilen hücreler için, forseps ile yavaşça lamel kaldırın; PBS içinde daldırılması ile yıkayın. , 6-çukurlu bir plaka içerisinde yetiştirilen hücreler için, PBS yıkama ve aspirasyon ekleyin. Bu noktada onlar ters bir mikroskop altında incelemek için hazırız. Aşırı PBS kurtulmak için bir Kimwipe hafifçe lamel kenarına dokunun. Bir cam slayt montaj jel damla ekleyin ve slayt üzerine lamel ters çevirin. Aspirasyon ile aşırı montaj jel çıkarın. Kabarcıklarını çıkarmak için 200 ul pipet ucunun arka hafifçe lamel dokunun. 4 ° C'de yaklaşık 20 dakika ya da O / N, oda sıcaklığında ve bir fl altında incelemek Kuruuorescent veya konfokal mikroskop. Parafin Gömülü ICCS Proteinlerin 3. (İsteğe bağlı) Immunofluorescent Boyama % 3 agaroz çözüm hazırlayın ve serin 55-60 ° C'yi izin Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de, 15 ml konik tüp süspansiyon içinde inkübe ÜAK'lerin ve santrifüj aktarın. Hücrelerden ortam aspire ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 ul% 4 PFA ile tamir. Pelet çok büyük olmadığı sürece, pelet karışmaz. 750 ul PBS ile iki kez pelet yıkayın. % 4 PFA gibi, bu atık tehlikeli olarak kabul edilir ve kurumun tehlikeli atık özelliklerine göre atılmalıdır. Yavaşça 15 ml konik tüp duvarında aşağı agaroz 150-200 ul gevşetin ve eklemek üzere hücre pelleti hafifçe vurun. Yavaşça tüp hafifçe karıştırın, ama kabarcıkları oluşturmaz. 5-10 dakika boyunca 4 ° C'de katılaşmaya izin verin. Çıkarmak için bir 21 G iğne kullanıntaze 15 ml konik bir tüp içinde pelet ve bir yer. Slaytlar üzerinde parafin gömme ve bölümlerin hazırlanması mikrotom kullanılarak sitesinde ya da çekirdek mikroskopi tesisleri yapılabilir. Dokusu, hidrat Deparaffinize ve hızlı bir şekilde su ile yıkayınız. Kalan aldehit söndürmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.2 M glisin ekleyin. 2 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın slayt. Antijen toplamak için, sıcak bir plaka üzerinde kaynatmak için 10 mM sitrat tampon maddesi (pH 6.0) getirir. Geri bir raddeye gelmesini bekleyin ve 15 dakika bekleyin, tampon slaytlar daldırın. Ocak gelen beher çıkarın. Tampon soğumaya slaytlar için yaklaşık 40 dakika bekleyin. , 5 dakika her biri için, H2O ile iki kez yıkanır slaytlar her biri 5 dakika boyunca PBS ile iki kere yıkayın slaytlar 1 saat için PBS içinde% 2 normal eşek serumu ile bloke eder. % 0.2 Triton X-100 ihtiva eden Çalışma Tampon doğru konsantrasyona seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.Genel olarak, birinci antikor, bir gece boyunca inkübe edilir transkripsiyon faktörleri ve 1.5 saat için boyama durumunda ise hormonlar, proliferasyon işaretleri ve / veya farklılaşması için boyama. Yukarıda tarif edilen adımları 2,3-2,9 izleyin.

Representative Results

Fetal ICCS dikkatli hazırlanması, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Hücreler tipik olarak kaplama tanımlanacağı dönemlerde bak nasıl Örnek resim, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Saflaştırmadan sonra, taze kaplama hücre agregatları az hücreleri (Şekil 2A) içeren küçük, seyrek açık kümeleri görünür. İlk 24 saat (Şekil 2B) sonra, hücre kümeleri çok daha büyük olur, ancak çok sayıda küçük kümeler kalır. 48 saat ile, kümeler önemli ölçüde genişletilmiş, ancak (Şekil 2C) asimetrik kalır gelmiştir. 72 saat sonra, SKK, boyutu ve şekli (Şekil 2D) nispeten homojen bir açık olmalıdır. Bu tür hücreler ya HTB-9, 24 saat önce, bağışıklık ya da gen ifadesini değiştirebilir ya da yokluğunda kimyasal madde veya ilaç varlığında, diğer bir 72 saat için büyümeye bırakılmıştır olarak matrisler, üzerinde kaplama olabilir, bu noktada pankreatik endokrin hücre g için gereklidireneration. 3 vurgulamaktadır pankreas endoderm karşı ICC proliferasyonu veya farklılaşmasını ya değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir antikor, bir dizi Şekil. Şekil 3A'da, SKK, HTB-9 ekildi 4 gün boyunca yetiştirilir ve PDX1, pankreas gelişiminin önemli bir marker için boyandı. ICCS in vitro boyama laboratuvarımızda rutin olmasına rağmen, daha sık olarak, insan fetal SKK, çıplak farelerin böbrek kapsülü altında yerleştirildi ve çoğalırlar ve in vivo 6,9,30-32 olarak ayırt etmek için izin verilir. Transplantasyonundan sonra belirli zamanlarda, fareler kurban edilir ve nakledilen ÜAK'lerin içeren böbrek çıkartılır,% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve parafin içine gömülmüştür. Sıralı 5 mikron bölümleri mikrotom kullanılarak sitesinde veya bir çekirdek mikroskopi tesisi yoluyla oluşturulur. Epitop olduğunu ortaya çıkarması ve immünofloresan mikroskopi için parafin dokusundan proteinlerin boyama isteğe bağlı protokol 3,10-3 tarif edilmektedir.. Hücre çoğalmasını değerlendirmek için ve Ki67 (kırmızı) ile, 17 Şekil 3B'de olarak, nakledilen SKK epitel hücre işaretleyici pan sitokeratin (yeşil PanCK) ile boyandı. Bir başka örnekte, insan insülini (yeşil) ve glukagon (kırmızı) hem de çıplak bir fare (Şekil 3C) ve böbrek kapsülü altında nakli ve olgunlaşma sonra tespit edilmiştir. Şekil 1.. Immünofloresans insan fetal ICC hazırlanması ve boyama akış şeması. Şekil 2,. 0 ° C'de Örnek fetal SKK hazırlanması, sonra kaplama 24, 48, ya da 72 saat. (A) SKKsüspansiyonu hemen sonra kaplama görüntülenmiştir, kaplama ya da (D) kaplama sonrası 72 saat sonra, (B) 24 saat sonra kaplama, (C) 48 saat. AC Ölçek çubuğu, 10X büyütme = 300 mikron, D ölçek bar = 100 mikron 20 büyütme. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. .. (, Yeşil pan-CK) ve çoğalma (Ki67, kırmızı), (C) insülin kaplamalı ICCS Şekil 3 İmmünofloresan Rutin, SKK, (A) pankreas Ceninin işaretleyici PDX1 (yeşil), (B) endokrin hücreleri için görüntülü (yeşil) ve glukagon (kırmızı). AC Ölçek çubuğu, 40X büyütme = 20 um.

Discussion

Burada sunulan yöntemler, hücre çoğalması ve pankreas endoderm belirteçleri, insan fetal, pankreas ve daha sonra görüntü ÜAK'lerin oluşturmak için bir olanak sağlar. Insan fetal pankreas ayrışma işlemi, 72 saat ICC oluşum süresi, fare hücre β projenitör hücreleri izole etmek için protokolleri esas olarak farklı olan bir yaklaşım, ardından yaklaşık 90 dakika gerektirmiştir. Burada sunulan protokol araştırmacı insan fetal pankreas gelişimini keşfetmek sağlayan bir tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Uzunlamasına çalışmalarda iki farklı yapılabilir. İlk olarak, farklı gebelik yaşı fonksiyonel pankreatik hücre tipleri (duktal hücreleri, ekzokrin hücreleri ve hormon pozitif hücreler) oluşturmak üzere potansiyel transplantasyonundan sonra değerlendirilebilir. İkinci olarak, tek gebelik yaşından SKK, kültür içinde yetiştirilen seçilmiş farmakolojik maddeler ile tedavi edilen ve farklılıkları keşfetmek için ICC kültür sırasında farklı zaman noktalarında transplante edilebilirhücre kaderi. Şu anda, insülin üreten hücreler içine HESC farklılaşması yönelik olan büyük bir çaba ile, fizyolojik uyarıcıya tepki olarak insülin salgılanmasının ilişkili sorunlar tekrar gündeme edilmektedir. İnsan SKK fetal pankreas hücre çoğalması ve β hücre gelişimi bu kritik yönünü incelemek için eşsiz bir model sistem sağlar.

Dokulardan hücreleri izole etmek için bir protokol ile olduğu gibi, detayları başarısı için kritik öneme sahiptir. Parametrelerin sayısı deneyi gerçekleştiren laboratuvar personelinin kontrolü dışında ne yazık ki. Bu laboratuvar tarafından karşılaşılan iki problem zayıf başlangıç ​​malzemesinin kalitesi ve pankreatik olmayan doku verilmesini içerir. Sağlıklı fetal pankreas dokusu bir makas kesim firmadır. Doku kesim çok kolay ise, pankreas enzimlerinin pankreas kendisi sindirimi başlamış olması bir işaretidir. Bundan hiçbir iyileşme ne yazık ki ve hazırlık iyi iptal edilir. Nadiren, bir inpankreas çıkarmadan deneyimli teknisyen pankreas için bağırsak bölümleri karıştırmayın olacaktır. Bu örnekler, pankreas çok daha fazla esnekliğe sahip olacak ve dikkate değer bir lümen mevcut olacaktır. Yine, bu örnekler atılmalıdır.

Yukarıda da değinildiği gibi protokol takip edildiğinde, pist dışında izolasyon atmak için ortaya herhangi bir sorun nadiren vardır. Pürüzsüz bir izolasyon sağlamak için hatırlamak için birkaç puan hassas pankreas kesim için keskin bir makas kullanın ve sindirmek için çok büyük herhangi bir doku örneği bırakmaz emin olmak için, içerir. Keser kadar küçük değilse, o zaman kollajenaz etkin çalışmaz ve birkaç SKK oluşur. Kolajenaz yeni bir toplu kullanırken sindirim için IU (uluslararası birim), daha önce kullanıldığı haliyle, tersine, eğer benzer bir seviyesi ile başlar. Ancak, aşırı sindirim oluşmaz sağlamak için kuluçka süresini azaltmak. Bu sorun giderme teknik IU etiket partiden ba anlamlı farklılık olmamasını sağlarltak.

Açıdan ele alındığında, insan fetal ICCS izolasyonu için bu teknik alanda oldukça standarttır. Çoğu laboratuarlar medyaya HGF'ün eklenmesi hücreleri 33 hayatta ve çoğalırlar yardımcı olur bizim bulgularını doğruladı. Özetle, biz 9 ila 23 hafta arasında değişen gebelik yaşları ile insan fetal ICCS taze pankreastan izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Hücreler, pankreatik endokrin transkripsiyon faktörlerini ve insan insülini görselleştirmek için bir tek tabaka ya da deneyleri için süspansiyon olarak yetiştirilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Rejeneratif Tıp (RB3-02266) için California Institute ve NIH (DK54441) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin – Streptomycin 100X Solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
AlexaFluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
AlexaFluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
AlexaFluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
AlexaFluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
  2. Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
  3. Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
  4. Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
  5. Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
  6. Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
  7. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  8. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
  9. Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
  10. Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
  11. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
  12. Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
  13. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
  14. Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
  15. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
  16. Van Hoof, D., D’Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
  17. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
  19. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
  20. Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
  21. Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
  22. Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
  23. Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
  24. Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
  25. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. . Pancreatic regeneration. , (1997).
  26. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
  27. Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
  28. Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
  29. Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
  30. Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
  31. Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
  32. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
  33. Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).

Tags

Human Fetal Pancreatic Cell ClustersInsulin Producing CellsEndocrine Precursor CellsHESCIn Vitro GenesisC-peptidePancreatic DevelopmentPancreatic EndodermPancreatic MarkersGlucagon

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image