Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

Merkt alvorens aan de slag: Foetale alvleesklieren werden verkregen uit de aangeboren afwijkingen Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), die het weefsel geoogst. Informed consent voor weefseldonatie, opslag en het gebruik van de monsters werd uit de donoren verkregen door het centrum. Het protocol toestemming verklaring werd schriftelijk verstrekt en de Universiteit van Californië, San Diego Human Research Protections Program goedgekeurd de gehele studie (Protocol # 081237XT). Het is essentieel om zowel de foetale pancreas en de container met de alvleesklier op ijs gedurende de gehele procedure te handhaven. De dissociatie en digestie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Stuur de kliniek waar de foetale pancreas werd verkregen uit de buffer voor opslag en transport van de alvleesklier. (RPMI-1640 + 10% normaal humaan serum (NHS), 300 mM trehalose SG, penicilline / streptomycine en fungizon). 1. Dissectie van foetale alvleesklier Los 5 mg RT collagenase XI in HBSS tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mg / ml. Filter steriliseer de oplossing met een 0,22 micron spuitfilter in een steriele (geautoclaveerd) scintillatieflesje en bewaar bij 4 ° C. In een weefselkweek kap, uiteengezet 2 steriele petrischaaltjes, een steriele kleine schaal (als een smeltkroes niet beschikbaar is, kan een kleine beker worden vervangen), gesteriliseerde schaar en pincet. Voeg 2 ml HBSS een petrischaal de alvleesklier wassen. Zuig vloeistof uit de buis met de foetale pancreas, laat ongeveer 1 ml. Verwijder de alvleesklier met een pincet in de 60 mm petrischaal zonder HBSS. Voor deze experimenten worden foetale ICC gegenereerd uit verse pancreata met gestational leeftijd variërend 9-23 weken. Isolatie van pancreata op jongere leeftijd gestionational moeilijk vanwege de grootte van de alvleesklier. Het protocol is waarschijnlijk van toepassing op zwangerschapsduur na 23 weken, maar acquisitie van pancreata na deze tijd moeilijk is vanwege de federale (VS) beperkingen. Af en toe, de foetale pancreas komt met milt-, vet-of bindweefsel bevestigd van de oorspronkelijke dissectie. De extra weefsel gemakkelijk met het blote oog en dienen van de alvleesklier voordat het protocol worden verwijderd. Spoel de alvleesklier in een minimaal volume koude HBSS (~ 0,5 ml) in de petrischaal. Verplaats de schoongemaakte alvleesklier om de kleine steriele smeltkroes met steriele pincet en plaats in een ijsemmer. Plaats de kroes in een houder voor een centrifugebuis van 50 ml en met behulp van 2 scharen, krachtig snijd de alvleesklier gedurende enkele minuten. (Gewoonlijk 2-5 minuten, maar het is afhankelijk van de grootte en stevigheid van het weefsel). Cutting techniek is belangrijk. Houd de ene kant van de schaar in een vaste positie te bewegen alleen het tegenovergestelde handgrepen. De uiteinden van de schaar moet rusten op de bodem van de kroes. Ga verder met de snelle schaar motie om de pancreas te breken in kleinestukken. Hoe kleiner de stukjes weefsel, hoe beter de collagenase werken. Voeg 1,5 ml HBSS + de gehakte alvleesklier om de flacon met de collagenase en plaats in een waterbad shaker set tot 37 ° C bij 200 rpm tot maximaal 10 minuten. Controleer niet vaker dan een keer tijdens de eerste 5 minuten. Spijsvertering is afhankelijk van het weefsel kwaliteit kan slechts 6 minuten voldoende. Het eindpunt is wanneer de deeltjes klein en uniform. Vul het flesje (10-15 ml) met koud HBSS de collagenase activiteit te stoppen. Plaats op ijs en laat de bosjes te regelen voor 10 minuten. Vaak op dit moment sommige celdood heeft plaatsgevonden en DNA wordt vrijgegeven in de media. Dit kan de media 'draderig' maken; in dit geval, voeg 100 ul DNase (10 mg / ml voorraad) aan de oplossing. Nadat het weefsel in de scintillatieflesje is geregeld voor 10 min, zuigen van de toplaag waardoor het iets minder dan de helft (7-8 ml). Breng de cellen om een ​​15 ml conische buis, Voeg 5 ml HBSS. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig het HBSS en resuspendeer de cellen in 5 ml medium dat RPMI-1640, glutamax, 10% normaal humaan serum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, penicilline / streptomycine en fungizon. Plaat op 60 mm petrischaal. Voor onderzoekers proberen β te genereren, voeg HGF (10 ng / ml eind) aan het medium. Bovendien, een aantal groepen hebben aangetoond dat aanvulling van het kweekmedium de incretine hormoon GLP-1 verhoogt ook β-cellen 28. De cellen moeten worden achtergelaten in suspensie voor 72 uur te aggregeren en te vormen ICC. Na 72 uur in suspensie kunnen cellen worden uitgeplaat op de matrix van de humane cellijn HTB9 matrix zoals eerder 29 beschreven. Ongeacht de groeiomstandigheden, moeten de media worden veranderd om de 48 uur. 2. Immunofluorescentie van merkers van Endocriene celproliferatie en rijping in ICC in suspensie gegroeid, Monolayer, of op glas Coverslips Om celproliferatie te bepalen, wordt BrdU labeling van zowel hechtende cellen of cellen in suspensie uitgevoerd gedurende 12 uur voorafgaand aan fixatie PFA. BrdU reagens verdund 1:100 en filter gesteriliseerd in RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicilline / streptomycine en fungizon. Voor cellen in suspensie: centrifugeren gedurende 5 min bij 300 xg en zuig kweekmedium. Voeg 10 ml PBS te wassen de ICC, centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 xg en aspireren. Als het ICC zullen worden ingebed in paraffine, volg facultatief protocol 3,1-3,17 Voor hechtende cellen:. Verwijder kweekmedium en wassen cellen met PBS zoals hierboven beschreven. Fix cellen voor 20 minuten met 4% PFA bij kamertemperatuur, vervolgens tweemaal wassen met PBS. Op dit punt kunnen de platen worden omwikkeld met Parafilm en opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende 1 week. Incubeer de cellen met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen tweemaal met PBS en toepassen Blocking Buffer (2% doennkey serum, 2% runderserumalbumine, 50 mM glycine verdund in PBS) gedurende 1 uur. Was de cellen met Working Buffer (Blokkeringsbuffer 1:10 verdund). Verdun het antilichaam in werkbuffer. Voor cellen gekweekt op dekglaasjes, verdunnen het antilichaam in 60 ul totaal volume. Voor cellen in een 6-putjes Verdun het antilichaam in 600 ul totaal volume. Om meerdere epitopen vlek, kan een cocktail van antilichamen worden toegepast. Als controle gebruikt IgG of pre immune serum in plaats van specifiek antilichaam. Controlemonsters worden geïncubeerd met controle IgG van dezelfde soort als het primaire antilichaam gebruikt. Incubeer het primaire antilichaam ofwel 1,5 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Zuig het primaire antilichaam en was 3x met Werken Buffer bij RT. Verdun het secundaire antilichaam bij 1:200 voor Rhodamine en FITC geconjugeerde antilichamen, 1:500 – 1:1000 voor Alexa geconjugeerde antilichamen. Het is belangrijk op te merken dat alle secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Bedek de monstersin aluminiumfolie om signaalverlies te voorkomen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Optioneel: om de kernen te visualiseren, kan DAPI worden toegevoegd aan 1:500 tijdens de tweede incubatie. Dit is handig voor kwantificering van eiwitexpressie in de totale celpopulatie. Zuig het secundaire antilichaam en was 3x met Werken Buffer bij RT. Voor cellen gekweekt op een dekglaasje, til het dekglaasje met een tang, terwijl ondergedompeld in de buffer; wassen door onderdompeling in PBS. Voor cellen gekweekt in een 6-wells plaat toevoegen PBS te wassen en zuigen. Op dit moment zijn ze klaar om te onderzoeken onder een omgekeerde microscoop. Raak de rand van het dekglaasje voorzichtig op een Kimwipe om zich te ontdoen van overtollige PBS. Voeg een druppel montage gel op een glasplaatje en keer het dekglaasje op de dia. Verwijder overtollig montage gel door aspiratie. Tik op het dekglaasje voorzichtig met de achterkant van een 200 ul pipet tip om luchtbellen te verwijderen. Droog bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 20 minuten of O / N bij 4 ° C en onderzocht onder een fluorescentie of confocale microscoop. 3. (Optioneel) immunofluorescentiekleuring van eiwitten uit paraffine ingebedde ICC Bereid een 3% agarose-oplossing en laat afkoelen tot 55-60 ° C. Breng de ICC geïncubeerd in suspensie een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het medium van de cellen en bevestig met 500 pi 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Laat de pellet niet mengen, tenzij de pellet is zeer groot. Was de pellet twee keer met 750 pl PBS. Net als de 4% PFA, wordt dit afval als gevaarlijk beschouwd en dienen te worden vernietigd volgens de specificaties van gevaarlijk afval van uw instelling. Tik zachtjes tegen de cel pellet los te maken en voeg 150-200 ul van de agarose langs de wand van de 15 ml conische buis. Meng door zachtjes te tikken de buis, maar bellen niet vormen. Laten stollen bij 4 ° C gedurende 5-10 minuten. Gebruik een 21 G naald te verjagende pellet en plaats in een verse 15 ml conische buis. Paraffine inbedding en de bereiding van de punten op de dia's kan worden gedaan ter plaatse met een microtoom of door uw core microscopie faciliteiten. Deparaffinize weefsel, hydrateren, en wassen met water snel. Voeg 0,2 M glycine gedurende 30 min bij RT om het resterende aldehyd blussen. Was de dia tweemaal met PBS gedurende 2 minuten elk. Voor antigen retrieval, brengen 10 mM citraat buffer (pH 6,0) aan de kook over hete plaat. Dompel de dia's in de buffer, wachten tot het weer aan de kook komen, en wacht 15 minuten. Verwijder het bekerglas van de kookplaat. Wacht ongeveer 40 minuten voor de dia afkoelen in de buffer. Was de dia tweemaal met H2O gedurende 5 min elk, was de dia tweemaal met PBS gedurende 5 minuten elk blok met 2% normaal ezel serum in PBS gedurende 1 uur. Incubeer met primaire antilichaam, verdund tot de juiste concentratie Bruikbare buffer bevattende 0,2% Triton X-100.In het algemeen wordt het primaire antilichaam overnacht geïncubeerd als kleuring voor transcriptiefactoren en 1,5 uur als kleuring op hormonen, merkers van proliferatie en / of differentiatie. Volg de stappen 2,3-2,9 hierboven beschreven.