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Medicine

L'isolement, la culture, et de l'imagerie de l'homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50796
, , ,
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics,University of California, San Diego

Summary

Un protocole d'isoler, les grappes de la culture, et de l'image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d'agrégats, et l'image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

Abstract

Depuis presque 30 ans, les scientifiques ont démontré que les CIP fœtales humaines transplantées sous la capsule rénale de souris nude mûri dans le fonctionnement des cellules endocrines, comme en témoigne une augmentation significative de la circulation C-peptide humain suite à une stimulation du glucose 1-9. Toutefois in vitro, la genèse de cellules productrices d'insuline du CCI fœtaux humains est faible 10; résultats rappellent des expériences récentes réalisées avec des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), une source renouvelable de cellules très prometteurs comme traitement thérapeutique potentiel pour le diabète de type 1. Comme les CCI, la transplantation de CSEh différenciées partiellement générer glucose sensible, des cellules produisant de l'insuline, mais dans la genèse vitro de cellules productrices d'insuline à partir de CSEh est beaucoup moins robuste 11-17. Une compréhension complète des facteurs qui influencent la croissance et la différenciation des cellules précurseurs endocriniens exigera probablement des données générées par les deux CCI et ilSC. Si un certain nombre de protocoles existent pour générer des cellules productrices d'insuline à partir de CSEh in vitro 11-22, beaucoup moins existent pour les CCI 10,23,24. Une partie de cette différence vient probablement de la difficulté de travailler avec le pancréas foetal humain. À cette fin, nous avons continué à construire sur les méthodes existantes pour isoler les îlots fœtaux de pancréas humains dont l'âge gestationnel entre 12 et 23 semaines, cultiver les cellules en monocouche ou en suspension, et l'image de la prolifération cellulaire, les marqueurs du pancréas et des hormones humaines y compris le glucagon et C-peptide. CCI généré par le protocole décrit ci-dessous résultat en C-peptide de presse après la transplantation sous la capsule rénale de souris nude qui sont semblables aux taux de peptide C obtenus par la transplantation de tissus frais 6. Bien que les exemples présentés ici se concentrent sur la prolifération de l'endoderme pancréatique et β genèse de cellules, le protocole peut être utilisé pour étudier d'autres aspects du développement pancréatique, Y compris exocrine canalaire, et d'autres cellules produisant des hormones.

Introduction

Une première limitation à insuline thérapies de remplacement à base de cellules dans le diabète de type 1 est la rareté des îlots humains disponibles pour la transplantation. L'aptitude à réguler la prolifération et la différenciation des cellules précurseurs en cellules pancréatiques humaines productrices d'insuline qui répondent aux besoins métaboliques d'un état d'insulino-déficients reste une composante essentielle pour une thérapie à base de cellules pour traiter le diabète de type 1.

Jusqu'à l'avènement de cellules dérivées de CSEh productrices d'insuline, les cellules humaines pancréatiques endocrines du fœtus ou de leurs précurseurs ont été considérées comme des sources potentielles de cellules pour la transplantation clinique. Bien que le paysage scientifique et réglementaire a changé au cours des dernières années, il reste un besoin vital de comprendre comment le pancréas fœtal humain se développe. Beaucoup considèrent maintenant l'utilisation thérapeutique des cellules fœtales humaines comme peu probable, cependant, si les méthodes sûres et efficaces pour développer les cellules ont été établis, l'utilisation thérapeutique de ces cellules pourrait agAin être explorées. Un obstacle majeur qui reste est que la transformation in vitro de cellules pancréatiques fœtales humaines agrégats (CCI) en glucose sensible, sécrétant de l'insuline des cellules endocrines est actuellement un processus inefficace. Bien que beaucoup de travail sur près de 30 ans a élucidé et délimité le profil d'expression des facteurs de transcription nécessaires pour le développement de pancréas endocrine, il reste des lacunes dans nos connaissances sur la façon dont l'expression temporelle des facteurs de transcription est régulée et liée à la fonction des cellules.

Jusqu'à l'avènement de cellules dérivées de CSEh productrices d'insuline, les cellules humaines pancréatiques endocrines du fœtus ou de leurs précurseurs ont été considérées comme des sources potentielles de cellules pour la transplantation clinique. Bien que le paysage scientifique et réglementaire a changé au cours des dernières années, il reste un besoin vital de comprendre comment le pancréas fœtal humain se développe. Beaucoup considèrent maintenant l'utilisation thérapeutique des cellules fœtales humaines comme peu probable, mais si efficaceet des méthodes sûres pour développer les cellules ont été établis, l'utilisation thérapeutique de ces cellules pourrait à nouveau être explorée. Un obstacle majeur qui reste est que la transformation in vitro de cellules pancréatiques fœtales humaines agrégats (CCI) en glucose sensible, sécrétant de l'insuline des cellules endocrines est actuellement un processus inefficace. Bien que beaucoup de travail sur près de 30 ans a élucidé et délimité le profil d'expression des facteurs de transcription nécessaires pour le développement de pancréas endocrine, il reste des lacunes dans nos connaissances sur la façon dont l'expression temporelle des facteurs de transcription est régulée et liée à la fonction des cellules.

Récemment, le champ de cellules souches a employé les connaissances accumulées au sujet de l'expression temporelle du facteur de transcription au cours du développement des îlots de Langerhans pour entraîner la production de cellules qui expriment les marqueurs de cellules endocrines matures. Bien que la genèse des cellules productrices d'insuline à partir de CSEh et les cellules pluripotentes induites (iPSC) a fait substantielle etdes progrès significatifs au cours des dernières années, les protocoles les plus efficaces nécessitent deux phases de différenciation distinctes: 1) une différenciation in vitro tôt pour générer des cellules exprimant pancréatiques facteurs précurseur de transcription, suivis par 2) maturation in vivo après transplantation – un soi-disant «boîte noire «période. Pour aller de l'avant, les progrès dans la compréhension de la biologie sous-jacente maturation des îlots in vivo, indépendamment de la source de la cellule, doit être compris à un niveau biochimique. La similitude entre les résultats obtenus avec les CCI et les CSEh suggère qu'un certain nombre de processus biochimiques essentiels qui régissent la transition des cellules précurseurs pancréatiques humaines en cellules sécrétrices d'insuline, matures, sensibles glucose in vitro restent inconnus. Un élément central de cette compréhension sera de développer de nouvelles méthodes pour calculer les populations de cellules endocrines fonctionnelles à partir de cellules souches pancréatiques et CSEh, il faudra non seulement env biochimiqueoches qui élucident les événements de maturation, mais des méthodes pour analyser les changements.

Pourquoi croyons-nous que l'imagerie des cellules pancréatiques fœtales humaines est un aspect essentiel de détecter les changements dans l'îlot maturation? La réponse se trouve partiellement dans la quête de l'historique pour produire des cellules produisant de l'insuline. Les deux modèles et les systèmes de culture de tissus pour les précurseurs et les îlots pancréatiques ont permis aux chercheurs d'explorer les différences importantes qui existent entre la maturation des îlots d'animaux et d'îlots humains in vitro. Une limitation à l'exploration du développement du pancréas foetal humain est que l'âge gestationnel qui peuvent être légalement utilisés ne donnent lieu à des agrégats de cellules hétérogènes. Bien que les cellules humaines fœtales isolées ressemblent à des îlots, une coloration après culture in vitro à partir de l'âge gestationnel de 9-23 semaines révèle inférieure à 15% contiennent des marqueurs pour les cellules endocrines, avec la plupart des cellules non de coloration pour les hormones de Langerhans. Toutefois, après la transplantation et envivo maturation, la grande majorité des cellules expriment des marqueurs endocriniens 6,25. Les résultats de ces études sont repris aujourd'hui avec les protocoles de différenciation des CSEh qui ne sont en mesure de générer des populations modestes de cellules endocrines positifs d'hormones unique après différenciation in vitro. Méthodes in vitro pour améliorer populations de cellules d'hormones positifs seront probablement donner un aperçu des îlots in vivo maturation. En outre, la compréhension des événements moléculaires qui stimulent le développement du pancréas foetal humain sera probablement redoubler d'efforts pour obtenir des cellules productrices d'insuline à partir de CSEh et délimiter les mécanismes qui régulent la régénération des cellules β et transdifférenciation des cellules du pancréas plus loin.

Les similitudes entre les cellules du pancréas foetal humain et CSEh maturation peut être étendu à la fonction des cellules. Comme les cellules murines, les cellules fœtales humaines et des hESC différenciée sont incapables de produire de l'insuline en réponse au glucoseaprès îlot néoformation in vitro 26,27. Cependant, lors de la transplantation dans des souris nude et la maturation, les deux groupes d'îlots comme humains et de cellules produisant de l'insuline provenant de CSEh présentent un phénotype endocrinien. Trois mois après la greffe, près de 90% des cellules transplantées de deux populations sont insuline positif, et fonctionner normalement déterminée par la libération de C-peptide 17,26. Ces résultats indiquent que la transplantation fournit le contexte et non identifiés signaux qui favorisent la maturation des îlots. Protocoles d'imagerie optimisés, tels que celui décrit ici, pour les cellules pancréatiques fœtales humaines aideront dans la recherche pour identifier les facteurs qui modulent et accélèrent la maturation. Exploration biochimique fondamentale des cellules pancréatiques fœtales humaines et CSEh différenciées vers une lignée endocrinien à ce stade de développement est indispensable pour mesurer l'efficacité de la maturation.

Le protocole suivant, décrit dans Figure 1, fournit notre procédé actuel pour l'isolement de cellules pancréatiques foetales humaines, appelée CIP à partir de pancréas foetal humain total et l'imagerie de ces cellules. Ce protocole nécessite une préparation initiale de cellules à partir de tissu, qui peut être par la suite cultivées en monocouche ou en suspension. Préparation des cellules pour l'imagerie des marqueurs couramment utilisés endocrine de la prolifération cellulaire et de la maturation est décrite.

Génération et l'imagerie des CIP en l'absence ou en présence d'une variété d'agents chimiques modifiant fournit une méthode rapide, par rapport à des modèles de transplantation, pour aider à identifier des conditions de culture et des composés qui accélèrent la maturation des cellules pancréatiques foetales humaines en exocrine entièrement fonctionnel, canalaire, ou hormone produisant des cellules pancréatiques.

Protocol

Note avant de commencer: Pancréas foetal humain ont été obtenues à partir des anomalies congénitales de laboratoire de recherche, l'Université de Washington (Seattle, Washington, États-Unis) qui a capturé le tissu. Le consentement éclairé au don de tissus, le stockage et l'utilisation des échantillons a été obtenue à partir des bailleurs de fonds par le centre. La déclaration de consentement du protocole a été fournie par écrit et à l'Université de Californie, Programme Human Research Protections San Diego a approuvé l'ensemble de l'étude (Protocole # 081237XT). Il est essentiel de maintenir à la fois le pancréas foetal humain et le récipient contenant le pancréas sur de la glace pendant toute la procédure. La dissociation et la digestion doivent être effectuées aussi rapidement que possible. Envoyer la clinique où le pancréas foetal humain a été obtenu à partir de la mémoire tampon pour le stockage et le transport du pancréas. (RPMI-1640 + 10% de sérum humain normal (NHS), 300 mM tréhalose SG, pénicilline / streptomycine et fungizone). 1. Dissection du fœtus pancréas humain Dissoudre 5 mg de collagénase RT XI dans du HBSS pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg / ml. Filtre stériliser la solution avec un filtre à seringue de 0,22 micron dans un (autoclave) flacon à scintillation stérile et conserver à 4 ° C. Dans une hotte de culture de tissus, figurant deux boîtes de Petri stériles, un petit creuset stérile (si un creuset n'est pas disponible, un petit gobelet peut être substitué), des ciseaux stérilisés, et une pince. Ajouter 2 ml de HBSS à une boîte de Petri à laver le pancréas. Aspirer à partir du liquide dans le tube contenant le pancréas foetales, en laissant environ 1 ml. Retirer le pancréas avec une pince dans le 60 mm boîte de Petri sans HBSS. Pour ces expériences, les CCI fœtales sont générés à partir de pancréas frais avec l'âge gestationnel allant de 9 à 23 semaines. Isolement à partir de pancréas à des âges gestionational antérieures est difficile en raison de la taille du pancréas. Le protocole est probablement applicable à l'âge gestationnel au-delà 23 semaines, mais l'acquisition de pancreata après ce temps est difficile à cause de (US) les restrictions fédérales. De temps en temps, le pancréas foetal arrive avec la rate, de la graisse, ou tissu conjonctif joint de la dissection d'origine. Le tissu supplémentaire est facilement visible à l'oeil nu et doit être retiré du pancréas avant de commencer le protocole. Rincer le pancréas dans un volume minimal de HBSS froid (~ 0,5 ml) dans la boîte de Pétri. Déplacez le pancréas nettoyés au petit creuset stérile à l'aide de pinces stériles et les placer dans un seau à glace. Placer le creuset dans un support pour un tube de centrifugeuse de 50 ml et, en utilisant deux paires de ciseaux, découper le pancréas vigoureusement pendant plusieurs minutes. (Habituellement 2-5 min, mais le temps dépend de la taille et de la fermeté du tissu). Technique de coupe est important. Tenir un côté de la paire de ciseaux dans une position fixe de n'utiliser que les poignées opposées. Les pointes des ciseaux doivent reposer sur le fond du creuset. Continuer avec le mouvement de ciseaux rapide à briser le pancréas en petitmorceaux. Le plus petit des morceaux de tissu, plus la collagénase va fonctionner. Ajouter 1,5 ml de + pancréas hachés HBSS dans le flacon contenant la collagénase et placer dans un shaker set de bain d'eau à 37 ° C à 200 tpm pour un maximum de 10 min. Ne cochez pas plus d'une fois pendant les 5 premières minutes. temps de digestion dépend de la qualité du tissu, aussi peu que six minutes peut suffire. Le point final est lorsque les particules sont petites et uniformes. Remplir le flacon (10-15 ml) avec du HBSS froide pour arrêter l'activité de la collagénase. Placez sur la glace et permettre aux touffes de s'installer pour 10 min. Souvent, à ce stade, certains la mort cellulaire a eu lieu et l'ADN est libéré dans les médias. Cela peut rendre les médias «filandreuse»; dans ce cas, ajouter 100 ul DNase (10 mg / stock ml) à la solution. Après le tissu dans le flacon de scintillation a réglé pendant 10 minutes, aspirer la couche supérieure en laissant un peu moins de la moitié plein (7-8 ml). Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, Ajouter 5 ml de HBSS. Centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g. Aspirer le HBSS et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu contenant RPMI-1640, glutamax, 10% de sérum humain normal (NHS), HEPES 10 mM pH 7,2, pénicilline / streptomycine et fungizone. Plaque sur 60 mm boîte de Petri. Pour les chercheurs qui tentent de générer des cellules β, ajouter HGF (10 ng / ml final) pour les médias. En outre, un certain nombre de groupes ont montré que la supplémentation du milieu de culture avec l'hormone incrétine GLP-1 augmente également les cellules β 28. Les cellules doivent être laissés en suspension pendant 72 heures à s'agréger et former des CCI. Après 72 h en suspension, les cellules peuvent être ensemencées sur la matrice de la matrice de HTB9 de lignée cellulaire humaine comme décrit précédemment 29. Indépendamment des conditions de croissance, les médias doivent être changés tous les 48 heures. 2. Immunofluorescence de marqueurs de endocrinien prolifération cellulaire et la maturation dans les CCI cultivées en suspension, monocouche, ou sur verre Lamelles de Pour mesurer la prolifération cellulaire, soit de marquage BrdU des cellules adhérentes ou des cellules en suspension est effectuée pendant 12 heures avant fixation PFA. réactif de BrdU est diluée à 1:100 et stérilisé par filtration dans du RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, HEPES 10 mM pH 7,0, pénicilline / streptomycine et fungizone. Pour les cellules en suspension: Centrifuger pendant 5 minutes à 300 g et milieu de culture d'aspiration. Ajouter 10 ml de PBS pour laver les CCI, centrifugeuse pendant 5 min à 300 g et aspirer. Si les CCI vont être inclus dans la paraffine, s'il vous plaît suivez protocole facultatif 03.01 à 03.17 pour les cellules adhérentes. Supprimer milieu de culture et laver les cellules avec du PBS comme décrit ci-dessus. Fixer les cellules pendant 20 min à 4% PFA à température ambiante, puis laver deux fois avec PBS. A ce moment, les plaques peuvent être enveloppés avec du Parafilm et stockées dans du PBS à 4 ° C pendant 1 semaine. Incuber les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules deux fois avec du PBS et appliquer tampon de blocage (2% fairenkey sérum, 2% d'albumine de sérum bovin, 50 mM de glycine dilué dans du PBS) pendant 1 heure. Laver les cellules avec du tampon de travail (tampon de blocage dilué 1:10). Diluer l'anticorps dans un tampon de travail. Pour les cellules cultivées sur des lamelles de verre, diluer l'anticorps dans 60 ul de volume total. Pour les cellules dans un plat à 6 puits, diluer l'anticorps dans 600 ul volume total. Pour colorer des epitopes multiples, un cocktail d'anticorps peut être appliqué. En tant que témoin, utiliser IgG ou pré sérum immun à la place de l'anticorps spécifique. Les échantillons de contrôle doivent être mises en incubation avec IgG témoin de la même espèce que l'anticorps primaire utilisé. Incuber l'anticorps primaire soit 1,5 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Aspirer l'anticorps primaire et laver 3 fois avec le tampon de travail à la température ambiante. Diluer l'anticorps secondaire à 1:200 d'anticorps conjugués rhodamine et FITC, 1:500 – 1:1000 pour les anticorps conjugués Alexa. Il est important de noter que tous les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Couvrir les échantillonsdans du papier d'aluminium pour éviter une perte de signal. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. FACULTATIF: Pour visualiser les noyaux, DAPI peut être ajouté à 1:500 pendant l'incubation secondaire. Ceci est utile pour la quantification de l'expression des protéines dans la population cellulaire totale. Aspirer l'anticorps secondaire et laver 3 fois avec le tampon de travail à la température ambiante. Pour les cellules cultivées sur une lamelle, soulevez doucement la lamelle avec une pince en immersion totale dans la mémoire tampon; laver par immersion dans du PBS. Pour les cellules cultivées dans une plaque à 6 puits, ajouter PBS à laver et aspirer. À ce stade, ils sont prêts à examiner sous un microscope inversé. Appuyez sur le bord de la lamelle doucement sur un Kimwipe de se débarrasser de l'excès de PBS. Ajouter une goutte de gel de montage sur une lame de verre et inverser la lamelle couvre-objet sur la lame. Retirer le gel de montage excès par aspiration. Appuyez sur la lamelle doucement avec le dos d'une pointe de pipette 200 ul pour éliminer les bulles. Sec à température ambiante pendant environ 20 min ou O / N à 4 ° C et examiner sous un fluo ou microscope confocal. 3. (Facultatif) immunofluorescence des protéines de paraffine CCI embarqués Préparer une solution d'agarose à 3% et laisser refroidir à 55-60 ° C. Transférer les CIP incubées en suspension dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 1500 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer les médias à partir des cellules et fixer avec 500 pi 4% PFA pendant 10 min à température ambiante. Ne pas mélanger la pastille, à moins que la pastille est très grande. Laver le culot deux fois avec 750 ul de PBS. Comme la PFA à 4%, ce déchet est considéré comme dangereux et doivent être éliminés selon les spécifications de déchets dangereux de votre institution. Tapotez doucement le culot cellulaire pour desserrer et ajouter 150-200 pi de l'agarose vers le bas de la paroi du tube de 15 ml conique. Mélanger en tapotant doucement le tube, mais ne forment pas de bulles. Laisser se solidifier à 4 ° C pendant 5-10 min. Utiliser une aiguille de 21 G à délogerle culot et le placer dans un tube de 15 ml conique frais. Inclusion dans la paraffine et la préparation de coupes sur des lames peuvent être faites sur place à l'aide d'un microtome ou par vos principales installations de microscopie. Déparaffiner tissus, hydrate, et laver avec de l'eau rapidement. Ajouter glycine 0,2 M pendant 30 min à température ambiante pour étancher l'aldéhyde restant. Laver la lame à deux reprises avec du PBS pendant 2 min chacun. Pour la récupération de l'antigène, apporter tampon citrate 10 mM (pH 6,0) à ébullition sur plaque chauffante. Plonger les lames dans le tampon, attendez qu'il revienne à ébullition, et attendre pendant 15 minutes. Retirer le bécher de la plaque chauffante. Attendez environ 40 minutes pour les lames refroidir dans le tampon. Laver les lames deux fois avec du H 2 O pendant 5 minutes chacun, laver les lames deux fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, bloquer avec 2% de sérum d'âne normal dans du PBS pendant 1 h. Incuber avec l'anticorps primaire, dilué à la concentration correcte dans le tampon de travail contenant 0,2% de Triton X-100.En général, l'anticorps primaire est mis à incuber pendant une nuit, si la coloration pour des facteurs de transcription et pendant 1,5 heure si la coloration pour les hormones, les marqueurs de prolifération et / ou différenciation. Suivez les étapes 2.3 à 2.9 décrites ci-dessus.

Representative Results

Une préparation minutieuse des CIP fœtus est essentielle à la réussite de ce protocole. Images représentatives de la façon dont les cellules semblent généralement à des périodes définies après placage sont présentés dans la figure 2. Après purification, les agrégats de cellules fraîchement plaqué apparaissent comme de petits groupes de clairs rares qui contiennent peu de cellules (figure 2A). Après les 24 premières heures (Figure 2B), un grand nombre des agrégats de cellules deviennent plus grandes, mais de nombreuses petites grappes restent. En 48 heures, les groupes se sont considérablement développées, mais rester asymétrique (figure 2C). À 72 h, les CCI doivent être clairs, relativement uniforme dans la taille et la forme (figure 2D). C'est à ce moment que les cellules peuvent être soit étalées sur des matrices, telles que HTB-9, pendant 24 h avant d'immunofluorescence ou laissées se développer pendant 72 h un autre, en l'absence ou en présence de produits chimiques ou des médicaments qui peuvent altérer l'expression de gènes nécessaire pour pancréatique cellules endocrines generation. Figure 3 met en évidence un certain nombre d'anticorps couramment utilisés pour évaluer soit la prolifération de la CPI ou la différenciation vers endoderme pancréatique. Sur la figure 3A, les CIP ont été plaquées sur HTB-9, cultivées pendant 4 jours, et on les colore pour PDX1, un marqueur critique du développement du pancréas. Bien que la coloration in vitro des CIP est réalisée en routine dans notre laboratoire, le plus souvent, CCI fœtaux humains sont transplantés sous la capsule rénale de souris nude et autorisés à proliférer et se différencier in vivo 6,9,30-32. À des moments précis après la greffe, les souris sont sacrifiées et le rein contenant les CCI transplantés sont enlevés, fixés dans du paraformaldéhyde 4%, et inclus dans la paraffine. 5 um sections séquentielles sont générées directement sur place à l'aide d'un microtome ou par une installation de microscopie à noyau. Épitope démasquage et la coloration des protéines de paraffine tissus pour la microscopie d'immunofluorescence est décrit dans le protocole facultatif 3.10-3.17. Sur la figure 3B, les CIP transplantées ont été colorées avec le marqueur de cellules épithéliales pan cytokératine (PanCK; vert) et avec Ki67 (rouge) pour évaluer la prolifération cellulaire. Dans un autre exemple, à la fois de l'insuline humaine (vert) et le glucagon (rouge) ont été détectés après la transplantation et de la maturation sous la capsule rénale d'une souris nude (Figure 3C). Figure 1. Diagramme de la préparation de la CPI foetal humain et coloration pour immunofluorescence. Figure 2. Représentant de préparation CCI fœtale à 0, 24, 48, ou 72 heures après l'étalement (A) CIP.en suspension ont été imagées immédiatement après placage, (B) 24 heures après l'étalement, (C) 48 heures après l'étalement, ou (D) 72 heures après l'étalement. La barre d'échelle pour AC, grossissement 10X = 300 um, barre d'échelle D, 20 grossissement = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. .. Figure 3 immunofluorescence des CIP plaqués Régulièrement, les CCI sont imagée pour (A) la PDX1 marqueur de l'endoderme pancréatique (vert), (B) des cellules endocrines (pan-CK; vert) et la prolifération (Ki67, rouge), (C) l'insuline (vert) et le glucagon (rouge). La barre d'échelle pour AC, 40X = 20 um.

Discussion

Les méthodes présentées ici permettent de générer un CIP à partir de pancréas foetal humain et par la suite l'image des marqueurs de la prolifération cellulaire et l'endoderme pancréatique. Le processus de dissociation du fœtus pancréas humain nécessaire environ 90 minutes, suivie d'une période de formation de la CCI 72 h, une approche qui est sensiblement différent de protocoles d'isoler des cellules progénitrices des cellules β de souris. Le protocole présenté ici fournit une méthode reproductible qui permet au chercheur d'explorer le développement du pancréas fœtal humain. Deux types d'études longitudinales différentes peuvent être réalisées. En premier lieu, le potentiel de générer des types de cellules pancréatiques fonctionnelles (cellules canalaires, les cellules exocrines et les cellules positives aux hormones) à partir de différents âges gestationnels peut être évaluée après la transplantation. Deuxièmement, les CCI de l'âge gestationnel unique peuvent être mises en culture, traitées avec des agents pharmacologiques sélectionnées et transplantées à différents moments au cours de la culture de la CPI à explorer les différencesdans le destin des cellules. Avec les énormes efforts actuellement réalisés à la différenciation des CSEh en cellules productrices d'insuline, les problèmes liés à la sécrétion d'insuline en réponse à des stimuli physiologiques sont de nouveau relancé. CCI de l'homme fournissent un système de modèle unique d'étudier cet aspect critique de fœtus prolifération des cellules β du pancréas et le développement des cellules.

Comme avec n'importe quel protocole pour isoler les cellules des tissus, les détails sont essentiels à la réussite. Un certain nombre de paramètres sont malheureusement en dehors du contrôle du personnel de laboratoire effectuant l'expérience. Deux problèmes rencontrés par ce laboratoire, comme la mauvaise qualité des matériaux de départ et la livraison des tissus non-pancréatique. Tissu pancréatique fœtus sain est ferme pour une coupe de ciseaux. Si les coupes de tissus trop facilement, c'est un signe que les enzymes pancréatiques ont commencé à digérer le pancréas lui-même. De cela, il n'est malheureusement pas la récupération et la préparation est meilleure annulée. Rarement, une danstechnicien expérimenté enlever le pancréas va dérouter sections de l'intestin pour le pancréas. Ces échantillons devront beaucoup plus d'élasticité que le pancréas et une lumière notable seront présents. Encore une fois, ces échantillons doivent être jetés.

Lorsque le protocole ci-dessus est suivie comme décrit, il ya rarement des questions qui se posent à jeter l'isolement sur la bonne voie. Quelques points à retenir pour assurer une isolation lisse comprennent, d'utiliser des ciseaux bien aiguisés pour couper du pancréas précis et assurez-vous de ne laisser aucun échantillon de tissu trop gros à digérer. Si les coupes sont pas assez petit, alors la collagénase ne fonctionne pas efficacement, et quelques CCI sont formés. Inversement, lorsque vous utilisez un nouveau lot de collagénase, commencer avec un niveau similaire si UI (unités internationales) pour la digestion que ceux utilisés précédemment. Cependant, diminuer le temps d'incubation pour s'assurer que plus de digestion ne se produit pas. Cette technique de dépannage assure que l'étiquette UI ne varie pas sensiblement d'un lot à batch.

Pris en perspective, cette technique d'isolement des CIP fœtaux humains est relativement standard dans le domaine. La plupart des laboratoires ont confirmé nos résultats que l'addition de HGF aux médias aide les cellules survivent et prolifèrent 33. En résumé, nous avons développé une méthode pour isoler CCI fœtales humaines pancréas frais avec l'âge gestationnel allant de 9 à 23 semaines. Les cellules peuvent être cultivées en monocouche ou en suspension pour des expériences de visualiser pancréas endocrine facteurs de transcription et de l'insuline humaine.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Institut pour la médecine régénérative (RB3-02266) et le NIH (DK54441).

Materials

Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin – Streptomycin 100X Solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
AlexaFluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
AlexaFluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
AlexaFluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
AlexaFluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013
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Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).
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