El cultivo y mantenimiento<em> Clostridium difficile</em> En un ambiente anaeróbico
Summary
Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.
Abstract
Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.
Introduction
Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos 1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico 2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para C. difficile prospere 2. C. difficile se transmite como una espora latente a través de la vía fecal-oral y posteriormente germina dentro del tracto gastrointestinal, produciendo células vegetativas capaz de generar varias toxinas y causando la enfermedad grave y la colitis 3. CDI suelen ser refractarios a los tratamientos convencionales y estos eninfecciones son frecuentemente recurrente 4. Como resultado, los CDI son responsables de hasta $ 4.8 mil millones en costos de atención de la salud en los Estados Unidos 5-7.
C. difficile es muy sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Para C. difficile de persistir en el medio ambiente y se transmite de manera eficiente de un huésped a otro, la formación de una espora metabólicamente inactiva es crítica 8. Debido a que el mantenimiento de laboratorio y la manipulación de C. difficile requiere un ambiente anaeróbico controlado, estas técnicas requieren el uso de una cámara anaeróbica. El uso de cámaras anaeróbicas se ha traducido en un aumento de la recuperación y el aislamiento de anaerobios obligados 9-11, y ha permitido una serie de técnicas moleculares que se deben realizar en un ambiente anaeróbico.
Además de C. difficile, el uso cámara anaeróbica y mantenimiento descritos aquí son aplicablesa otros anaerobios obligados, como otras especies clostridiales (por ejemplo, C. perfringens), otras especies gastrointestinales (por ejemplo, especies de Bacteroides 12) y patógenos periodontales (por ejemplo, especies de Peptostreptococcus 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Coy Laboratorios amablemente para proporcionar imágenes de la cámara anaeróbica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención DK087763 (SMM) y un plan de estudios STEP / HHMI Desarrollo de la Confraternidad (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
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