زراعة وصيانة<em> المطثية العسيرة</em> في بيئة لاهوائية
Summary
المطثية العسيرة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي هي احيوائية صارمة ويسبب الإسهال المضادات الحيوية المرتبطة بها (AAD). هنا، طرق عزل، زراعة والحفاظ على C. وصفت الخلايا والجراثيم الخضري صعب. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، الأمر الذي يتطلب صيانة دورية لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. زراعة صعب.
Abstract
المطثية العسيرة هو، اللاهوائية، البكتيريا إيجابية الجرام مولد الأبواغ التي هي المسؤولة في المقام الأول عن المضادات الحيوية المرتبطة الاسهال (AAD) وهو الممرض المستشفيات كبيرة. C. صعب أمر بالغ الصعوبة لعزل وزراعة وحساس للغاية حتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. هنا، وأساليب لعزل C. صعب من عينات البراز وزراعة احقا C. يتم عرض صعب لإعداد مخزون الجلسرين للتخزين على المدى الطويل. وكما وصفت تقنيات لإعداد وتعداد الأسهم بوغ في المختبر لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك المصب المجهري والدراسات على الحيوانات. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، والتي تحافظ على البيئة اللاهوائية متسقة لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. النمو صعب. نحن نقدم بروتوكولات لنقل المواد داخل وخارج الغرفة دون كاليفورنياباستخدام تلوث الأكسجين كبيرة جنبا إلى جنب مع اقتراحات للصيانة العادية المطلوبة للحفاظ على البيئة اللاهوائية المناسبة لكفاءة ومتسقة C. زراعة صعب.
Introduction
المطثية العسيرة هو، بكتيريا تشكيل بوغ الغرام الإيجابية التي هو احيوائية تلزم والممرض الجهاز الهضمي قاتلة للبشر والحيوانات. وصفت في البداية في عام 1935 كما كائن المتعايشة وجدت في عينات البراز من الأطفال حديثي الولادة 1، C. وقد تجلى صعب في وقت لاحق أن يكون العامل المسبب لالتهاب القولون الغشائي الكاذب المرتبطة العلاج بالمضادات الحيوية 2. C. وعادة ما يسبق الالتهابات صعب (CDI) عن طريق العلاج بالمضادات الحيوية مما يؤدي إلى اختلال النباتات القولون العادية، وخلق مكانة لC. صعب أن تزدهر 2. C. تبث صعب باعتبارها بوغ نائمة من طريق البراز إلى الفم، وتنبت في وقت لاحق داخل القناة الهضمية، وإنتاج الخلايا النباتية قادرة على توليد العديد من السموم وتسبب أمراض شديدة والتهاب القولون 3. CDI غالبا ما تكون العلاجات التقليدية لصهر وهذه فيوكثيرا ما تكرر ذكر fections 4. ونتيجة لذلك، CDI هي مسؤولة عن ما يصل إلى 4.8 مليار دولار في تكاليف الرعاية الصحية في الولايات المتحدة الأمريكية 5-7.
C. صعب حساس جدا لحتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. لC. صعب أن تستمر في البيئة وأن تنتقل بكفاءة من المضيف إلى المضيف، وتشكيل بوغ غير نشط أيضي حرجة 8. لأن صيانة المختبرات والتلاعب C. يتطلب صعب بيئة اللاهوائية التي تسيطر عليها، هذه التقنيات تتطلب استخدام حجرة اللاهوائية. وقد أدى استخدام غرف اللاهوائية في زيادة الانتعاش والعزلة من اللاهوائيات تلزم 9-11، وسمحت لعدد من التقنيات الجزيئية التي يتعين القيام بها في جو اللاهوائية.
بالإضافة إلى C. صعب، واستخدام غرفة اللاهوائية والصيانة وصفها هنا قابلة للتطبيقلاللاهوائيات تلزم أخرى مثل الأنواع الأخرى اللاهوائية (مثل المطثية الحاطمة)، والأنواع الأخرى الهضمي (مثل الأنواع باكتيرويديز 12) ومسببات الأمراض اللثة (مثل الأنواع الهضمونية العقدية 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة هنا يسمح للانتعاش بسيط وسريع للC. صعب من مجموعة متنوعة من عينات البراز، بما في ذلك البشر والفئران والهامستر، فضلا عن التخزين الطويل الأمد للC. صعب كما الجلسرين أو بوغ الأسهم. C. صعب يمكن أن يكون كائن من الصعب زراعة، ولكن صيانة حذرا من بي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر معامل كوي لتوفير يرجى صورا للغرفة اللاهوائية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK087763 (SMM) والمناهج STEP / HHMI زمالة التنمية (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
- Hall, I. C., O’Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants – With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis – Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O’Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
