Het kweken en onderhouden<em> Clostridium difficile</em> In een anaëroob milieu
Summary
Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.
Abstract
Clostridium difficile is een Gram-positieve, anaërobe, sporogenic bacterie die primair verantwoordelijk is voor antibiotica geassocieerde diarree (AAD) en is een belangrijke nosocomiale pathogenen. C. difficile is notoir moeilijk te isoleren en cultiveren en is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Hier, werkwijzen voor het isoleren C. difficile van fecale monsters en vervolgens het kweken van C. difficile voor de bereiding van glycerol bestanden langetermijnopslag gepresenteerd. Technieken voor het bereiden en het opsommen spore aandelen in het laboratorium voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals microscopie en dierlijke studies beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die een consistente anaëroob milieu te zorgen voor een juiste omstandigheden voor een optimale C. onderhoudt difficile groei. Wij bieden protocollen voor de overdracht van materialen in en uit de kamer zonder camet behulp van aanzienlijke verontreiniging zuurstof samen met suggesties voor regelmatig onderhoud nodig om de juiste anaëroob milieu te ondersteunen voor een efficiënte en consistente C. difficile teelt.
Introduction
Clostridium difficile is een grampositieve, sporenvormende bacterie die een obligaat anaërobe en een potentieel fatale gastrointestinale pathogenen van mensen en dieren. Aanvankelijk beschreven in 1935 als een commensaal organisme gevonden in fecale monsters van pasgeborenen 1, C. difficile werd later aangetoond dat de verwekker van pseudomembraneuze colitis geassocieerd met antibiotica 2 zijn. C. difficile infecties (CDI) worden gewoonlijk voorafgegaan door antibiotische behandeling die resulteert in de verstoring van de normale darmflora, het creëren van een nis voor C. difficile te gedijen 2. C. difficile als een slapende spore via de fecaal-orale weg overgebracht en vervolgens ontkiemt in het maagdarmkanaal, vegetatief cellen kan genereren verscheidene toxine en veroorzaken ernstige ziekte en colitis 3. CDI zijn vaak ongevoelig voor conventionele behandelingen en deze infections worden vaak terugkerende 4. Daardoor CDI zijn verantwoordelijk voor $ 4,8 miljard aan gezondheidszorgkosten in de Verenigde Staten 5-7.
C. difficile is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Voor C. difficile te blijven in het milieu en efficiënt worden overgedragen van gastheer naar gastheer, de vorming van een metabolisch inactieve spore is van cruciaal belang 8. Omdat het laboratorium onderhoud en manipulatie van C. difficile is een gecontroleerde, anaëroob milieu, deze technieken vereisen het gebruik van een anaërobe kamer. Gebruik van anaërobe kamers heeft geleid tot een toegenomen terugwinning en isolatie van obligate anaerobe 9-11, en heeft geleid tot een aantal moleculaire technieken in een anaërobe atmosfeer worden uitgevoerd.
Naast C. difficile, de anaërobe kamer gebruik en onderhoud hier beschreven toepassingandere obligate anaerobe bacteriën zoals Clostridium andere soorten (bijv. C. perfringens), andere maag-soorten (bijvoorbeeld Bacteroides soorten 12) en periodontale pathogenen (bv. Peptostreptococcus species 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methoden is het mogelijk voor een eenvoudige en snel herstel van C. difficile uit verschillende fecale monsters, waaronder mensen, muizen en hamsters, alsmede de opslag van C. langdurige difficile glycerol of spore voorraden. C. difficile kan een moeilijke organisme te kweken, maar zorgvuldig onderhoud van een anaëroob milieu en de toepassing van aseptische technieken voor robuuste groei en een vermindering van verontreiniging.
Anaërobe k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Coy Laboratories bedanken voor vriendelijk verstrekken van foto's van de anaërobe kamer. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie DK087763 (SMM) en een STEP / HHMI Leerplanontwikkeling Fellowship (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
- Hall, I. C., O’Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants – With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis – Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O’Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
