Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron
Summary
Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.
Abstract
Neuriti, entrambi i dendriti e degli assoni, sono processi cellulari neuronali che consentono la conduzione degli impulsi elettrici tra i neuroni. Definire la struttura dei neuriti è fondamentale per capire come questi processi si muovono materiali e segnali che supportano la comunicazione sinaptica. La microscopia elettronica (EM) è stato tradizionalmente usato per valutare le caratteristiche ultrastrutturali all'interno neuriti, tuttavia, l'esposizione a solventi organici durante la disidratazione e resina embedding può distorcere strutture. Un importante obiettivo insoddisfatto è la formulazione di procedure che consentano alle valutazioni strutturali non interessate da tali artefatti. Qui, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato e riproducibile per la coltivazione e il flash congelamento neuriti interi di diversi neuroni primari di elettroni griglie di microscopia seguita dalla loro esame con crio-elettroni tomografia (crio-ET). Questa tecnica permette di visualizzazione 3-D di surgelati, neuriti idratati a risoluzione nanometrica, facilitando assessment delle loro differenze morfologiche. Il nostro protocollo produce una visione senza precedenti della radice dorsale ganglio (DRG) neuriti, e una visualizzazione dei neuriti dell'ippocampo nel loro stato quasi native. Come tali, questi metodi creano una base per gli studi futuri su neuriti di entrambi i neuroni normali e quelle colpito da disturbi neurologici.
Introduction
I neuroni stabiliscono il complesso essenziale circuiteria per la funzione del sistema nervoso centrale e periferico elaborando dendriti ricevere informazioni e assoni, spesso molto lunghe, per comunicare con i neuroni a valle. Crescita dei neuriti gioca un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione e la manutenzione di neuriti neuronale supporta criticamente la funzione del sistema nervoso. Processi neuritic dispongono inoltre criticamente in danno neuronale e rigenerazione, così come disturbi del sistema nervoso. Lo studio di architettura neuronale è fondamentale per capire sia il cervello normale e malato. Fortunatamente, fisiologicamente rilevanti sistemi di coltura di cellule neuronali esistono che possono ricapitolare strutture cellulari complesse ed eterogenee. Sulla base della spiegazione di piattaforme sperimentali solide strategie di visualizzazione efficaci che consentano analisi qualitative e quantitative di morfologia neuronale sono necessari. Particolarmente utile sarebbeuna metodologia dettagliata che fornisce una piattaforma coerente per la visualizzazione neuriti, sia assoni e dendriti in scala nanometrica.
Microscopia elettronica tradizionale richiede l'uso di solventi organici durante la disidratazione e l'incorporamento resina, che può indurre distorsioni nei campioni dal loro vero stato. Ad oggi, la maggior parte delle caratterizzazioni strutturali a scala nanometrica sono basati su cellule o tessuti più grandi che sono sottoposti a tali sostanze chimiche aggressive – limitando così l'interpretazione dei risultati 4,9,25. Inoltre, per la penetrazione fascio di elettroni, sezionamento è necessaria per gli organismi o sporgenze cellulari che presentano uno spessore maggiore di 1 micron 12. Infine, sezionato o lavorato risultati tessuto in collezione di insiemi di dati discreti specifico slice, rendendo ingombrante la definizione della funzione allungata di neuriti. Anche per crio-EM, in cui sezionando un campione congelato-idratato è possibile, il metodo introduce artif compressioneatti 1.
Negli ultimi anni, i ricercatori hanno imparato a coltivare i neuroni dell'ippocampo direttamente su griglie EM e-flash congelamento loro in etano liquido per visualizzare successivamente neuriti con crio-ET 8,10,18,23. Tuttavia, tali studi né usano un dispositivo su misura 10,23, oppure dettagli mancanza sul gradino assorbente per la generazione di ghiaccio vitreo abbastanza sottile per la visualizzazione di routine 8,18. Per esempio, uno studio raccomanda l'uso di 30-40 sec per blotting griglia EM 10, tuttavia, questo valore non è ottimizzata per uso generale, ma è specifico per il dispositivo-tuffo congelamento misura. Utilizzando un dispositivo su misura, piuttosto che un disponibile in commercio un 17 per mantenere l'umidità prima di immergersi congelamento del campione potrebbe rappresentare un ostacolo per la diffusa riproducibilità.
Anche se questi studi sono stati Innovativo nel visualizzare neuriti da crio-ET, abbiamo compiuto un ulteriore passo avanti per esplorare l'applicability di crio-ET ad una varietà di esemplari neuronali (ippocampo e gangli delle radici dorsali neuroni). Inoltre, si discute sia i risultati ottimali e non ottimali, così come i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari.
Definizione di una tecnica dettagliata per la conservazione e la visualizzazione di neuriti interi su scala nanometrica in uno stato quasi native aumenterebbe la possibilità per i più ricercatori di effettuare studi ultrastrutturali. A tal fine, si descrive un protocollo efficace e dettagliato utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la preparazione non fissati, i neuroni non colorati per visualizzare neuriti. Questo è un primo importante passo verso dettagliare l'ultrastruttura dei neuriti sani e di gettare le basi per capire quali sono presenti in modelli di malattia del sistema nervoso differenze strutturali. Poiché crio-ET in grado di risolvere non fissate, le caratteristiche dei neuriti non colorati in 3-D su scala nanometrica, il metodo renderà possibile, come mai esserepertanto definire architettura neuritic 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato che i neuroni di ratto embrionali (ganglio della radice dorsale e ippocampo) possono essere coltivate su oro microscopia elettronica (EM) griglie e congelati in ghiaccio vitreo abbastanza sottile per i loro neuriti essere ripreso con 2-D Cryo-EM e 3-D crio- ET. Mentre neuriti dell'ippocampo sono stati precedentemente fotografato con crio-ET 8,10,18,23, un protocollo abbastanza dettagliato per la replica di successo utilizzando dispositivi disponibili in commercio è stata carente. Inolt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS è stato sostenuto da una borsa di studio dal Nanobiologia Interdisciplinare Graduate Program Formazione del WM Keck Center for Interdisciplinary Bioscience formazione della Costa del Golfo Consorzi (NIH di Grant No. T32EB009379).
SHS sezionato, crebbe e vetrificati DRG e cellule dell'ippocampo, raccolte crio-ET dati di DRG e assoni ippocampo Cryo-EM e, ricostruito e colore-annotato la serie tilt. MRG sezionato e fornito cellule dell'ippocampo nel laboratorio di MNR. SC assistito in serie tilt annotazione. SHS è stato addestrato da CW su come sezionare e crescere neuroni. SHS, WCM e WC concepito gli esperimenti. SHS preparato il manoscritto con il contributo di altri autori.
Questo video è stato girato presso il Centro di Imaging Cellulare e NanoAnalytics (C-CINA), del Biozentrum di tegli Università di Basilea. C-CINA è integrato nel Dipartimento per Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) del Politecnico federale di Zurigo, che si trova a Basilea, in Svizzera.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
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