Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography
Summary
Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.
Abstract
Neurieten, zowel dendrieten en axonen, zijn neuronale cellulaire processen die de geleiding van elektrische impulsen tussen neuronen mogelijk. Het definiëren van de structuur van neurites is cruciaal om te begrijpen hoe deze processen te verplaatsen materialen en signalen die synaptische communicatie ondersteunen. Elektronenmicroscopie (EM) is van oudsher gebruikt om de ultrastructurele functies binnen neurites beoordelen, maar kan de blootstelling aan organische oplosmiddelen tijdens uitdroging en hars inbedding structuren verstoren. Een belangrijke onvervulde doel is het formuleren van procedures die het mogelijk maken voor structurele evaluaties niet beïnvloed door dergelijke artefacten. Hier hebben wij een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor het kweken en Snelkoelen geheel neurieten van verschillende primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door de behandeling met cryo-electron tomografie (cryo-ET) vastgesteld. Deze techniek maakt 3-D visualisering van bevroren gehydrateerd neurieten op nanometer resolutie vergemakkelijken assessment van hun morfologische verschillen. Ons protocol levert een ongekend uitzicht op dorsale wortel ganglion (DRG) neurites, en een visualisatie van de hippocampus neuronen in hun buurt-inheemse staat. Als zodanig zijn deze werkwijzen maakt een basis voor toekomstige studies neurieten van zowel normale neuronen en die beïnvloed door neurologische stoornissen.
Introduction
Neuronen stellen de complexe schakelingen essentieel zijn voor de functie van het centrale en perifere zenuwstelsel door de uitwerking dendrieten en axonen informatie, vaak nogal lang, communiceren downstream neuronen ontvangen. Neuriet uitgroei speelt een fundamentele rol tijdens embryonale ontwikkeling en neuronale differentiatie en onderhoud van neurieten ondersteunt de kritische functie van het zenuwstelsel. Neuritische processen hebben ook kritisch in neuronale schade en herstel, evenals aandoeningen van het zenuwstelsel. De studie van neuronale architectuur is cruciaal voor zowel de normale en zieke hersenen te begrijpen. Gelukkig, fysiologisch relevante neuronale celkweek systemen bestaan die kunnen complexe en heterogene cellulaire structuren recapituleren. Gebaseerd op de opheldering van vaste experimentele platforms, effectieve visualisatie strategieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyses van neuronale morfologie mogelijk nodig. Vooral nuttig zouzijn een gedetailleerde methodologie die een consistent platform voor het visualiseren neurites, zowel axonen en dendrieten op de nanometer schaal biedt.
Traditionele elektronenmicroscopie vereist het gebruik van organische oplosmiddelen bij uitdroging en hars inbedding, die verstoringen kunnen veroorzaken in de monsters uit hun ware staat. Tot op heden zijn de meeste structurele karakteriseringen op nanometerschaal op basis van grotere cellen of weefsels die worden blootgesteld aan zulke agressieve chemicaliën – en dus de interpretatie van de bevindingen 4,9,25 beperken. Bovendien, voor elektronenbundel penetratie, snijden is vereist voor organismen of cellulaire uitsteeksels vertonen een dikte van meer dan 1 urn 12. Tenslotte doorsnede of gemalen weefsel leidt verzameling van discrete slice-specifieke datasets, waardoor omslachtige de definitie van de langwerpige kenmerk van neurieten. Zelfs voor cryo-EM, waarbij snijden diepvriesbewaarruimte gehydrateerde monster mogelijk is, stelt de werkwijze compressie artifhandelingen 1.
In de afgelopen jaren hebben onderzoekers geleerd hoe hippocampusneuronen direct groeien op EM roosters en-flits bevriezen ze in vloeibare ethaan om vervolgens neurites visualiseren met behulp van cryo-ET 8,10,18,23. Echter, deze studies gebruik maken van een hulpmiddel naar maat 10,23, of het ontbreken details over de blotting stap voor het genereren dun genoeg glasvocht ijs voor routinematige visualisatie 8,18. Bijvoorbeeld, een studie adviseert het gebruik van 30-40 seconden voor blotting de EM rooster 10, maar wordt deze waarde niet geoptimaliseerd voor algemeen gebruik, maar is specifiek voor die custom-made-duik bevriezing apparaat. Met behulp van een op maat gemaakte inrichting in plaats van een commercieel verkrijgbaar een 17 voor het behoud van vocht voorafgaand aan een duik-bevriezing van het monster kan een hindernis voor grootschalige reproduceerbaarheid opleveren.
Hoewel deze studies zijn baanbrekend visualiseren neurieten door cryo-ET, hebben we een stap verder naar de ap verkennentoepasselijkheid van cryo-ET van verschillende neuronale specimens (hippocampus en dorsale wortel ganglion neuronen). Daarnaast bespreken we zowel optimale en suboptimale resultaten, alsook de mogelijke artefacten die men zou kunnen optreden bij het gebruik cryo-ET voor dergelijke specimens.
Het definiëren van een gedetailleerde techniek voor het behoud en het visualiseren hele neurites op de nanometer schaal in een near-native staat zou de mogelijkheid voor meer onderzoekers om ultrastructurele studies uit te voeren verbeteren. Daartoe doeltreffende en gedetailleerd protocol beschrijven we de handel verkrijgbare apparatuur losgemaakt, onbesmet neuronen bereiden neurieten visualiseren. Dit is een belangrijke eerste stap in de richting waarin de ultrastructuur van gezonde neurites en de basis te leggen voor het begrijpen van wat structurele verschillen aanwezig in het zenuwstelsel ziekte modellen. Sinds cryo-ET niet vastgelegde, onbesmet neuriet functies op nanometerschaal kan oplossen in 3-D, zal de methode maakt het mogelijk als nooitvoorgrond neuritische architectuur 12 definiëren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We zien dat rat embryonale neuronen (dorsale wortel ganglion en hippocampus) kunnen worden gekweekt op goud elektronenmicroscopie (EM) roosters en glasachtige ijs dun genoeg zijn neurieten worden afgebeeld met behulp van 2-D cryo-EM en 3-D cryo-ingevroren ET. Terwijl hippocampus neurites eerder zijn afgebeeld met behulp van cryo-ET 8,10,18,23, een protocol gedetailleerd genoeg voor een succesvolle replicatie met behulp van commercieel beschikbare apparaten heeft ontbroken. Bovendien, terwijl hun onderzoek het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek is ondersteund door de NIH subsidies (PN2EY016525 en P41GM103832). SHS werd ondersteund door een beurs van de Nanobiology Interdisciplinair Graduate Training Program van de WM Keck Centrum voor Interdisciplinaire Bioscience Training van de Gulf Coast Consortia (NIH Grant No T32EB009379).
SHS ontleed, groeide en verglaasd DRG en hippocampuscellen; verzameld cryo-EM en cryo-ET gegevens van DRG en hippocampus axonen, gereconstrueerd en kleur-geannoteerde de tilt-serie. MRG ontleed en voorzien hippocampuscellen in MNR het lab. SC bijgestaan in tilt serie annotatie. SHS werd opgeleid door CW over hoe om te ontleden en te groeien neuronen. SHS, WCM en WC bedacht de experimenten. SHS bereid het manuscript met de input van andere auteurs.
Deze video is gefilmd bij het Centrum voor Cellulaire Beeldvorming en NanoAnalytics (C-CINA) van de Biozentrum van thij universiteit van Basel. C-CINA is geïntegreerd in het Departement for Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) van de ETH Zürich, gevestigd in Bazel, Zwitserland.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
