إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون
Summary
للحفاظ على العمليات العصبية لتحليل التركيبية، ونحن تصف بروتوكول للتصفيح من الخلايا العصبية في المقام الأول على شبكات المجهر الإلكتروني تليها فلاش تجميد، مما أسفر عن عينات معلقة في طبقة من الجليد الزجاجي. يمكن فحص هذه العينات باستخدام المجهر البرد الإلكترون لتصور هياكل على مقياس متناهي الصغر.
Abstract
neurites التي، على حد سواء التشعبات والمحاوير، هي العمليات الخلوية العصبية التي تمكن من توصيل النبضات الكهربائية بين الخلايا العصبية. تحديد هيكل neurites التي أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية نقل هذه المواد والعمليات التي تدعم إشارات الاتصالات متشابك. المجهر الإلكتروني (EM) وقد استخدمت تقليديا لتقييم ميزات التركيبية داخل neurites التي، إلا أن التعرض للمذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين يمكن أن تشوه الهياكل. هدف غير الملباة المهم هو صياغة الإجراءات التي تسمح للتقييمات الهيكلية لا تتأثر هذه القطع الأثرية. هنا، وضعنا بروتوكولا مفصلة وقابلة للتكرار لزراعة وتجميد فلاش neurites التي كاملة من الخلايا العصبية الأولية المختلفة على شبكات المجهر الإلكتروني تليها الفحص مع التصوير المقطعي البرد الإلكترون (البرد ET). هذا الأسلوب يسمح لل3-D التصور، neurites التي رطب مجمدة في القرار نانومتر، وتسهيل ASSEssment خلافاتها الشكلية. بروتوكول لدينا تعطي نظرة غير مسبوقة من الظهرية جذر عقدة (DRG) neurites التي، وتصور neurites التي الحصين في حالتها شبه الأم. على هذا النحو، وهذه الأساليب إنشاء مؤسسة للدراسات المستقبلية على neurites التي كل من الخلايا العصبية الطبيعية وتلك التي تأثرت الاضطرابات العصبية.
Introduction
الخلايا العصبية إنشاء مجمع الدوائر الأساسية لوظيفة الجهاز العصبي المركزي والمحيطي من خلال وضع التشعبات لتلقي المعلومات والمحاور، وغالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وعلى التواصل مع الخلايا العصبية المصب. ثمرة neurite يلعب دورا أساسيا أثناء التطور الجنيني وتمايز الخلايا العصبية وصيانة neurites التي تدعم بشكل حاسم وظيفة الجهاز العصبي. عمليات التهاب الأعصاب أيضا ميزة بالغة في إصابة الخلايا العصبية والتجديد، فضلا عن اضطرابات الجهاز العصبي. دراسة الهندسة المعمارية العصبية أمر حاسم لفهم كل من المخ المعتادة والمريضة. لحسن الحظ، توجد نظم زراعة الخلايا العصبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي يمكن أن ألخص الهياكل الخلوية المعقدة وغير المتجانسة. استنادا إلى توضيح من المنصات التجريبية الصلبة والاستراتيجيات الفعالة التي تمكن التصور التحليلات الكمية والنوعية من مورفولوجيا الخلايا العصبية وهناك حاجة. سيكون مفيدا بشكل خاصتكون منهجية التفصيلية التي توفر منصة متسقة لتصور neurites التي، على حد سواء محاور عصبية والتشعبات على مقياس متناهي الصغر.
يتطلب المجهر الإلكتروني التقليدية استخدام المذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين، والتي يمكن أن تحدث تشوهات في عينات من الدولة الحقيقية. حتى الآن، وتستند معظم الأوصاف الهيكلية في مقياس متناهي الصغر على خلايا أكبر أو الأنسجة التي تتعرض لمثل هذه المواد الكيميائية القاسية – مما يحد من تفسير النتائج 4،9،25. علاوة على ذلك، لاختراق شعاع الالكترون، مطلوب باجتزاء للكائنات أو نتوءات الخلوية واظهار سمك أكبر من 1 ميكرون 12. أخيرا، مقطوع أو المضروب نتائج الأنسجة في مجموعة من مجموعات البيانات شريحة محددة منفصلة، مما يجعل مرهقة تعريف ميزة ممدود من neurites التي. حتى لالبرد EM، التي باجتزاء عينة مجمدة رطب هو ممكن، وطريقة يدخل ضغط artifيتصرف 1.
في السنوات الأخيرة، عرف الباحثون كيفية زراعة الخلايا العصبية قرن آمون مباشرة على شبكات EM ولهم في الايثان السائل بعد ذلك لتصور neurites التي تستخدم البرد ET 8،10،18،23 تجميد فلاش. ومع ذلك، مثل هذه الدراسات إما استخدام جهاز حسب الطلب 10،23، أو عدم التفاصيل حول الخطوة النشاف لتوليد ما يكفي من الجليد رقيقة زجاجي لرؤية الروتينية 8،18. على سبيل المثال، توصي دراسة واحدة استخدام 30-40 ثانية لالنشاف الشبكة EM 10، ومع ذلك، تم تحسين هذه القيمة ليست للاستخدام العام ولكن هي محددة لهذا الجهاز تجميد يغرق حسب الطلب. يمكن استخدام الجهاز حسب الطلب بدلا من المتاحة تجاريا واحدة للحفاظ على الرطوبة 17 قبل العينة لتجميد يغرق-تشكل عقبة للاستنساخ على نطاق واسع.
في حين أن هذه الدراسات قد تم الرائدة في تصور neurites التي كتبها البرد ET، اتخذنا خطوة أخرى لاستكشاف ا ف بplicability من البرد ET إلى مجموعة متنوعة من العينات العصبية (قرن آمون والظهرية العقدة الجذر الخلايا العصبية). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نناقش كل الأمثل والأمثل النتائج، فضلا عن القطع الأثرية المحتملة التي يمكن للمرء أن تواجه باستخدام البرد ET لمثل هذه العينات.
أن تعريف تقنية مفصلة للحفاظ على وتصور neurites التي كله على مقياس متناهي الصغر في حالة شبه الأصلي تعزيز قدرة لمزيد من الباحثين لإجراء دراسات التركيبية. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تصف بروتوكول فعالة ومفصلة باستخدام المعدات المتاحة تجاريا لإعداد غير المثبتة، الخلايا العصبية غير ملوثين لتصور neurites التي. هذا هو خطوة أولى مهمة نحو تفاصيل التركيب الدقيق للneurites التي صحية ووضع الأساس لفهم ما هي موجودة في نماذج المرض الجهاز العصبي الاختلافات الهيكلية. منذ البرد ET يمكن حل غير المثبتة، وميزات محوار غير ملوثين في 3-D على مقياس متناهي الصغر، فإن الطريقة تجعل من الممكن أبدا أن يكون كماالصدارة لتعريف العمارة التهاب الأعصاب 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبين لنا أن الفئران الخلايا العصبية الجنينية (العقدة الجذرية الظهرية وقرن آمون) يمكن زراعتها على الذهب المجهر الإلكتروني (EM) شبكات ومجمدة في الجليد الزجاجي رقيقة بما يكفي لneurites التي ليمكن تصوير باستخدام 2-D البرد EM و 3-D البرد ET. في حين سبق تصويرها neurites التي الحصين باست…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (PN2EY016525 وP41GM103832). وأيد SHS من قبل الزمالة من برنامج تدريب الخريجين Nanobiology التخصصات من مركز WM كيك لتدريب التخصصات العلوم البيولوجية من اتحادات ساحل الخليج (NIH منحة رقم T32EB009379).
SHS تشريح، نما والمزجج DRG وخلايا قرن آمون؛ جمعها البرد EM والبيانات البرد ET من DRG ومحاور الحصين؛ بناؤها والمشروح لون سلسلة الميل. التجمع تشريح وقدمت خلايا قرن آمون في مختبر MNR ل. SC ساعدت في سلسلة الميل الشرح. تم تدريب SHS بواسطة CW حول كيفية تشريح وتنمو الخلايا العصبية. SHS، WCM ومرحاض تصور التجارب. أعد SHS المخطوطة مع مدخلات من مؤلفين آخرين.
تم تصوير هذا الفيديو في مركز التصوير الخلوية وNanoAnalytics (C-سينا) من Biozentrum رانه جامعة بازل. تم دمج C-سينا في إدارة النظم البيولوجية للعلوم والهندسة (D-BSSE) ETH زيورخ لل، وتقع في بازل، سويسرا.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
