İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma
Summary
Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.
Abstract
Th17 hücreleri 17 (IL-17), interlökin üretmek için tespit edilmiştir T hücrelerinin bir alt kümesi ayrı olan ve Th1, Th2 ve düzenleyici T hücreleri dahil olmak üzere, diğer T hücre alt ikinci fonksiyon farklıdır. Th17 hücreler çok oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili çok istekli inflamatuar immün cevapların merkezi bir suçlu olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemde biz C57BL / 6 farelerinin dalak ve lenf düğümleri T lenfositleri arındırmak ve kontrol ve Th17 uyaran ortamlarda saflaştırılmış CD4 + T hücrelerini teşvik eder. Th17 uyaran ortam anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları, IL-6 ve TGF-β varlığında uyarımı içerir. En az 72 saat süre ile inkübe edildikten sonra ve 37 ° C'de en fazla beş gün boyunca, hücreler daha sonra sitometrisi, QPCR, ELISA ve akış boyunca IL-17 üretmek için yeteneği açısından analiz edilir. Th17 farklılaşmış CD4 + CD25-T hücreleri daha Th17 hücreleri otoimmün ve ev sahibi de başlangıcı ve ilerlemesinde oynadığı rolü aydınlatmak için kullanılabilirfense. Ayrıca, farklı kemirgen nakavt / hastalık modellerinde CD4 + CD25-lenfosit Th17 farklılaşma hücre kaderi plastisite anlamamıza katkıda bulunabilir.
Introduction
CD4 + T lenfositler (T hücreleri), bulaşıcı mikroorganizmalara karşı bağışıklık sistemi aracılı savunma önemli bir rol oynamaktadır. Tersine, T-hücreleri, aynı zamanda iyice bu tip 1 diyabet, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. CD4 + T lenfositleri, T hücresi reseptörü kognat antijeni / majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II) molekülleri ile (TCR) etkileşimlerinin bir kombinasyonu ile aktif hale gelir ve B7.1/B7.2 ile CD28 reseptör etkileşimleri 15 ligandları. TCR ve CD28 uyarımı ko-stimülasyon sağlanmasına ek olarak, antijen sunan hücreler de bu şekilde belirli bir antijene T lenfosit yanıtı yönlendirme, T lenfosit farklılaşması durumunu belirleyen bir sitokin ortam sağlar. Farklı patojen / antijen sunan hücre etkileşimleri T eli odaklanmış farklı yollar aşağı lenfosit çarpık ayrı sitokin ortamları oluşturmak,başlatılması patojen ele almaktadır. Ne yazık ki, orijinal olarak, istila eden patojenlere ortadan kaldırmak için tasarlanmış T lenfosit efektör yolları, hatalı kendi dokularına 15 karşı yönlendirilebilir. Bu nedenle, her farklı CD4 + T hücre alt sitesini farklılaşması durumunun daha iyi anlaşılması patojenlerin ortadan kaldırılması ve kendini hoşgörü arasındaki dengeyi düzenleyen nasıl anlayışımız için çok önemlidir.
Th1, Th2 ve indüklenebilir düzenleyici T hücresi farklılaşma yollarının ek olarak, naiv T lemfositleri aynı zamanda Th17 yolunun aşağı sitokinler tarafından tahrik edilebilir. Th1 hücreleri, hücre içi patojenlere mücadele ise, Th2 hücreleri, hücre-dışı patojenlerin uzaklaştırılması ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) enflamatuar tepkileri 1, 16, en aza indirmek, Th17 hücre dışı bakteri ve mantar yok edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Th17 hücreler genel olarak soy spesifik transkripsiyon faktörü ve IL RORγT üretim ifadesi ile gösterilirMakrofajlar ve nötrofiller 1, 7 aktivasyonunu teşvik-17A.
Th17 hücreler çeşitli otoimmün hastalıklarda rol oynadığı ve bunların ilişkili kemirgen modelleri edilmiştir. Örneğin, IL-23 (Th17 fenotipi sürdürmek için gerekli olan) olduğu gösterilmiştir, ancak IL-12, deneysel otoimmün ensefalitte (EAE) 'de, merkezi suçlu olduğu, MS için kemirgen hastalık modeli. Bu, daha sonra IL-17 üretiminde azalma EAE önleme 2, 6, 17 ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri arterit ve sistemik lupus eritematosus (SLE) 10, 16 dahil olmak üzere diğer oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olmuştur. IL-23 p19 eksikliği olan – / – fareler Th17 hücrelerinin çok az sayıda olduğu gösterilmiştir ve EAE sadece gelişen karşı dirençli olan, ama aynı zamanda kollajen ile indüklenen artrit, romatoid artrit 10, 18 için bir model. Buna ek olarak, fare kıç IL-17A, nötralize edici antikor ile işleme tabier kollajen kaynaklı arterit başlangıcı da eklem hasarı 18 çözünürlüğe sahip olduğu bulunmuştur. Bu son araştırmalar aynı zamanda, Tip 1 diyabet 9, 11 ve bağırsak iltihabı 14 Th17 hücre koruyucu bir rol gösterildiği gibi otoimmün hastalık ilerlemesinde Th17 hücrelerinin rolünün, özelliği gerekmektedir unutulmamalıdır. Bu çalışmalar otoimmünitede Th17 farklılaşma önemini doğrulamaktadır.
1) tam olarak nasıl IL-6 Treg ve Th17 farklılaşma arasındaki dengeyi düzenleyen etmez ve 2) kesin mekanizmaları nelerdir: daha fazla araştırılması gereken en az iki kafa karıştırıcı soru vardır çünkü in vitro Th17 farklılaşma T hücre araştırmalarındaki gerekli bir yöntemdir IL-17 kaynaklı enflamatuvar hastalıkların arkasında? Bizim yöntem olup, C57BL / 6 fare dalak ve lenf düğümleri CD4 + CD25-T hücreleri kullanır. Şunu belirtmek önemlidir ki bir saf olmayan kullanılarak Th17 farklılaşmasını teşvik etmek mümkün olmasına rağmenNüfus, en az bir% 80 saf CD4 + CD25-T hücresi popülasyonu elde herhangi bir kirlenme ortadan endişe ve daha başarılı Th17 farklılaşma sonuçlar sağlar. Uygun Th17 farklılaşma elde etmek için, CD4 + CD25-T-hücreleri, sırasıyla, anti-CD3 ve anti-CD28, aktivasyon sinyalleri sağlamak, 1 ve 2 varlığında inkübe edilir, ve IL-6 ve TGF-β. IL-23 tek başına Th17 farklılaşma elde etmek için kullanılabilir olduğunu rapor edilmiş olmasına rağmen, bu daha sonra IL-23 Th17 hücre popülasyonunun istikrarı için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, IL-6 ve TGF-β Th17 farklılaşması için gerekli olan 3, 18, 19. Murin çalışmalar, IL-23 reseptör IL-6 ve TGF-β 13, 18 ile uyarılmış sonra CD4 + T hücreleri üzerinde ifade olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri başarılı olduğu sürece, IL-6 ve TGF-β 18, 19 mevcut olduğu gibi IL-23 bloke edici antikorların varlığı gelişecektir. Bu nedenle, bu Th17 farklılaşma protokol atabaşarıyla Th17 farklılaşma ikna etmek için uygun koşullar Ides. Otoimmün hastalıklar 13 hedefleyen daha iyi terapötik maddelerin geliştirilmesi için fırsat sunmaktadır Th17 farklılaşması ve IL-17 üretimini altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması geliştirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada in vitro Th17 farklılaşma ulaşmak için protokol tanımlanmıştır. T farklılaşma insan patojenleri 13 etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için kritik olan Th17 alt kümesi içine lenfositler gibi Th17 farklılaşma çalışma önemlidir. Tersine, IL17 üretim otoimmün hastalık ilerlemesi 13 ile ilişkilendirilmiştir. Bu, bağışıklık düzenleme ve otoimmünitenin çok sayıda farklı kemirgen modelleri için uygulanabilir olarak Th17 farklılaşma gibi bir yönt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Florida TL1 TR000066 ve UL1 TR000064, Ulusal Sağlık Enstitüsü, BD Biosciences reaktif hibe Veli Grant R01AI056152 bir çeşitlilik takviyesi Üniversitesi NIH / NCATS Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri ve Üniversite tarafından kısmen desteklenen Florida.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. v. a. n. o. v. F. r. u. t. o. s. R., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O’Connor, W., Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
