Summary

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Published: September 26, 2013
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Summary

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Abstract

Th17 são um subconjunto distinto das células T que foram encontrados para produzir interleucina-17 (IL-17), e diferem em função das outras subpopulações de células T, incluindo Th1, Th2, e células T reguladoras. Th17 surgiram como um culpado central em respostas imunitárias inflamatórias associadas com superzelosos muitas doenças auto-imunes. Neste método purificamos linfócitos T dos baço e linfonodos de camundongos C57BL / 6, e estimular as células T CD4 + purificadas sob controle e ambientes Th17 indutores. O meio de indução de Th17 inclui estimulação na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, IL-6, e do TGF-β. Após incubação durante pelo menos 72 horas e até cinco dias a 37 ° C, as células são subsequentemente analisados ​​para a capacidade de produzir IL-17 por meio de citometria de fluxo, qPCR, e ELISA. Th17 diferenciadas células CD4 + CD25-T pode ser utilizado para elucidar o papel que as células Th17 jogar no aparecimento e progressão de auto-imunidade e de acolhimentofense. Além disso, Th17 diferenciação de CD4 + CD25-linfócitos de modelos nocaute / doença murino distintas podem contribuir para a nossa compreensão da plasticidade destino celular.

Introduction

Os linfócitos T CD4 + (células T) desempenham um papel crítico na defesa mediado pelo sistema imunológico contra microrganismos infecciosos. Por outro lado, as células T são também intimamente associados com o aparecimento e progressão de doenças auto-imunes, tais como diabetes do tipo 1, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. Linfócitos T CD4 + são ativados através de uma combinação de receptor de células T (TCR) interações com antígeno cognato / complexo principal de histocompatibilidade II (MHCII) moléculas e as interações receptor CD28 com B7.1/B7.2 ligantes 15. Em adição à disposição de estimulação de TCR e CD28 co-estimulação, as células apresentadoras de antigénio também proporcionar um ambiente de citocinas, que determina o estado de diferenciação do linfócito T, orientando deste modo a resposta de linfócitos T para o antigénio determinada. Interações patógeno Distinct / célula apresentadora de antígeno criar ambientes de citocinas distintas, que distorcer linfócitos T por caminhos distintos focados na eliminação do patógeno iniciar. Infelizmente, T caminhos linfócitos efetoras, originalmente destinadas a erradicar patógenos invasores, podem ser erroneamente dirigida contra auto-tecidos 15. Portanto, uma melhor compreensão do estado de diferenciação de cada subconjunto de células T CD4 + distinta é fundamental para a nossa compreensão de como a modular o equilíbrio entre a eliminação de patógenos e tolerância à auto.

Além do tipo Th1, Th2, e T reguladoras vias de diferenciação das células indutiveis, linfócitos T virgens, também pode ser conduzido por baixo da via de citocinas Th17. Considerando que as células Th1 patogénios intracelulares de combate, as células Th2 eliminar agentes patogénicos extracelulares, e células T reguladoras (Tregs) minimizar as respostas inflamatórias 1, 16; Th17 desempenhar um papel importante na eliminação de bactérias extracelulares e fungos. Th17 são geralmente indicados por expressão do factor de transcrição específico da linhagem RORγT e produção de IL-17A, que promove a ativação de macrófagos e neutrófilos 1, 7.

Th17 têm sido implicados em várias doenças auto-imunes, e os seus modelos de roedores associados. Por exemplo, tem sido demonstrado que a IL-23 (que é necessária para sustentar o fenótipo Th17), mas não de IL-12, foi o culpado central em encefalite autoimune experimental (EAE), o modelo de roedor para a doença de MS. Foi posteriormente demonstrado que a redução na produção de IL-17, estão correlacionados com a prevenção de EAE 2, 6, 17. Além disso, as células Th17 têm sido associados com outras doenças auto-imunes, incluindo artrite e lúpus eritematoso sistémico (LES), 10, 16. IL-23 p19 deficiente – / – murganhos mostraram ter um número muito baixo de células Th17, e são resistentes ao desenvolvimento não só a EAE, mas também artrite induzida por colagénio, um modelo para a artrite reumatóide 10, 18. Além disso, os ratos tratados com anticorpos neutralizantes de IL-17A a réer o aparecimento de artrite induzida por colágeno também foram encontrados para ter resolução das lesões articulares 18. Deve notar-se que o papel de células Th17 na progressão da doença auto-imune permanece para ser caracterizado como a investigação recente tem mostrado também um papel protector das células Th17 em diabetes do tipo 1 9, 11 e 14 de inflamação intestinal. Estes estudos confirmam a importância da diferenciação Th17 na auto-imunidade.

Na diferenciação Th17 in vitro é um método necessário na pesquisa de células T, porque há pelo menos duas perguntas intrigantes que requerem investigação adicional: 1) Como exatamente IL-6 regulam o equilíbrio entre Treg e diferenciação Th17, e 2) Quais são os mecanismos exatos trás de IL-17 induzida por doenças inflamatórias? Nosso método utiliza células CD4 + CD25-de baço e gânglios linfáticos do C57BL / 6 mouse. É importante notar que, embora seja possível, para induzir a diferenciação de células Th17 usando um impuropopulação, a aquisição de, pelo menos, um puro CD4 + 80% população de células CD25-T nega qualquer preocupação de contaminação e garante mais bem-sucedidos resultados de diferenciação Th17. A fim de conseguir a diferenciação Th17 adequada, as células T CD4 + CD25-T são incubados na presença de anti-CD3 e anti-CD28, que fornecem sinais de activação, 1 e 2, respectivamente, e de IL-6, e TGF-β. Embora tenha sido relatado que a IL-23 por si só pode ser usada para conseguir a diferenciação Th17, que foi mais tarde demonstrado que a IL-23 é necessária para a estabilidade da população de células Th17, mas TGF-β IL-6 e são essenciais para a diferenciação de células Th17 3, 18, ​​19. Estudos em ratos demonstraram que o receptor de IL-23 é expresso em células T CD4 + apenas depois de terem sido estimuladas com IL-6 e TGF-β 13, 18. Além disso, as células Th17 irá desenvolver com êxito, na presença de anticorpos IL-23 de bloqueio desde que TGF-β IL-6 e que estão presentes 18, 19. Como tal, este protocolo prov diferenciação Th17ides as condições adequadas para induzir com sucesso diferenciação Th17. O desenvolvimento de uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes Th17 diferenciação e a produção de IL-17 apresentam a oportunidade para o desenvolvimento de melhores terapias destinadas a doenças auto-imunes 13.

Protocol

Todo o uso de animais foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e uso. 1. Preparação de Misturas e Mídia Estéril PBS pH: 7.3 (1 L) 0,23 g de NaH 2 PO 4 1.15 g de Na 2 HPO 4 9,0 g de NaCl Tome-se o volume com água DI. Esterilizar com autoclave. Cultura Celular Mídia (100 ml) 89 ml de RPMI <…

Representative Results

Este protocolo de diferenciação Th17 começa com a remoção do baço e axilar, braquial, mesentérica, do colo do útero, e os nódulos linfáticos inguinais. Uma representação dos locais de cada um pode ser encontrado nas Figuras 2 e 3. As Figuras 1 e 5, tanto fornecer uma representação visual dos métodos descritos neste protocolo. Este protocolo Th17 centra-se na diferenciação da população de linfócitos CD4 + CD25-T. É import…

Discussion

Aqui nós descrevemos o protocolo para alcançar diferenciação in vitro de células Th17. O estudo de diferenciação Th17 é importante, tal como a diferenciação de linfócitos T no subconjunto Th17 é crítico para a eliminação eficaz de agentes patogénicos humanos 13. Por outro lado, a produção de IL17 tem sido associada com a progressão da doença auto-imune 13. O método de diferenciação de células Th17 é aplicável a muitas situações de pesquisa, uma vez que pode ser …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado em parte pelo NIH / NCATS clínica e translacional Ciência para a Universidade da Flórida TL1 TR000066 e UL1 TR000064, um suplemento diversidade de Pais Grant R01AI056152 do Instituto Nacional de Saúde, um subsídio reagente BD Biosciences, e da Universidade da Flórida.

Materials

Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

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Cite This Article
Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

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